Aunque en ocasiones se realice la recogida de un solo embrión en el ganado vacuno, la mayoría de las transferencias de embriones en esta especie se hacen después de un tratamiento hormonal para superovular a las vacas donantes y maximizar la recuperación de los embriones durante el procedimiento de recogida. En el ganado vacuno, hay dos métodos de superovulación aceptados de forma general. Un método consiste en administrar una sola inyección (2 000-2500 U; IM) de gonadotropina coriónica equina (eCG) el día 10 del ciclo estral (en el que el día 0 se define como el día en que las vacas se observan en celo), y 2-3 días después se administrarán dos inyecciones de prostaglandina F2alfa (dinoprost o cloprostenol) con un intervalo de 12-24 h.
Actualmente, el método de elección en varios países es inducir la superovulación mediante administraciones seriadas de hormona foliculoestimulante (FSH). La respuesta superovulatoria inducida por el tratamiento con eCG a menudo es mayor que la inducida por la FSH; sin embargo, después del tratamiento con FSH se producen más embriones de calidad transferible (buena calidad). Por esta razón, la FSH se ha convertido en el método de elección para las vacas superovuladoras para uso comercial.
Las dos preparaciones comerciales de FSH más utilizadas están hechas de extractos de hipófisis porcina y contienen algo de contaminación de hormona luteinizante (LH). Mientras que las cantidades elevadas de LH en las preparaciones de FSH pueden interferir con la respuesta superovulatoria óptima, se cree que un nivel bajo de contaminación de LH no interfiere y puede incluso ser necesario para la superovulación. Los estudios que utilizan FSH recombinante no han encontrado ninguna mejora en el número de embriones transferibles.
Aunque se han descrito algunos buenos resultados con una sola administración, la FSH se suele administrar (IM) durante 4-5 días consecutivos, dos veces al día en dosis decrecientes. Ambas preparaciones comerciales de FSH pueden diluirse en 20 mL de solución salina (NaCl al 0,9 %) y administrarse durante 4-5 días. Un protocolo típico de tratamiento con FSH de 4 días es el siguiente: el día 1, 4 mL cada 12 horas; el día 2, 3 mL cada 12 horas; el día 3, 2 mL cada 12 horas; y el día 4, 1 mL cada 12 horas (volumen total = 20 mL). Los tratamientos suelen comenzar el día 10 después del estro. En el tercer o cuarto día de tratamiento con FSH se administra una inyección luteolítica de prostaglandina F2alfa y se repite 12 horas más tarde. El celo puede esperarse 36-48 horas más tarde, y la inseminación artificial puede programarse en función del celo observado (12 y 24 horas después del inicio del estro) o por cita (72, 84 y 96 horas después de la administración de PGF2alfa) que se acompaña de la administración de un agente para provocar la ovulación (p. ej., gonadotropina coriónica humana u hormona liberadora de gonadotropina [GnRH]).
Existen muchos métodos variados para aumentar la eficacia de los programas de superovulación en el ganado vacuno. Por ejemplo, la inducción de una nueva onda folicular antes de los tratamientos con gonadotropinas es aconsejable para aumentar la respuesta del ovario a los tratamientos superovulatorios. La respuesta a los tratamientos con FSH mejora si los tratamientos se inician en el momento de la aparición de una nueva onda folicular. Algunos ejemplos de abordajes para inducir una nueva onda folicular incluyen la inyección de estradiol, la inyección de GnRH y la aspiración transvaginal (ablación del folículo) del folículo dominante (conocida como eliminación del folículo dominante).
Una nueva onda folicular emerge 4, 2 o 1-2 días después de los tratamientos con estradiol, GnRH o EFD, respectivamente. Las respuestas a los tratamientos con gonadotropinas para inducir la superovulación son más eficaces cuando los tratamientos se inician cuando emerge la onda folicular. Estos tratamientos tienen como objetivo promover un reclutamiento y un crecimiento más uniforme del folículo que finalmente puede dar lugar a embriones más viables por procedimiento. En EE. UU. y en muchos otros países las preparaciones de estrógenos no estan permitidos para su uso en reproducción.
El manejo de las receptoras se puede hacer después de la observación del celo natural o basado en protocolos de sincronización. En cualquier caso, se administra una dosis luteolítica de PGF2alfa ~12 horas antes del primer tratamiento de PGF2alfa de vacas donantes. Las vacas receptoras que ovulan el mismo día que las vacas donantes son las mejores para la transferencia de embriones; sin embargo, una asincronía de ± 1 día ha producido tasas de gestación comparables a las de las receptoras perfectamente sincronizadas. Se espera que el 75-90 % respondan al tratamiento de superovulación; sin embargo, el 20-30 % de las vacas que reciben lavado uterino no producen embriones de calidad transferible. Para las vacas que responden con éxito al tratamiento con FSH, todavía existe la posibilidad de una notable variabilidad en la producción de embriones de buena calidad (de 0 a >20 por lavado). Una producción de 5-7 embriones de buena calidad (transferibles) por colección de embriones se considera un resultado comercial adecuado.
La recogida de embriones se realiza el día 7 del ciclo, que es cuando se espera recuperar los embriones en estadio uterino (mórula y blastocitos). Antes del procedimiento de recogida de embriones, se palpa la vaca donante y se evalúa la respuesta ovárica al tratamiento de superovulación mediante palpación rectal y ecografía para determinar el número de cuerpos lúteos en los ovarios. En este momento, la detección precoz de presuntos quistes foliculares puede resultar útil para desarrollar tratamientos hormonales después del procedimiento de recogida de embriones para resolver la afección quística.
El procedimiento para recoger los embriones del útero (lavado) implica los siguientes pasos:
Se administra una epidural con 5-7 mL de lidocaína.
Se lava cuidadosamente el perineo con jabón de manos o un exfoliante antiséptico (clorhexidina o yodo); según el tamaño del animal y del cuello uterino, se introduce en la vagina un catéter tipo Foley de 12-24 F colocado sobre una varilla de metal (estilete) mientras que el brazo palpador se coloca en el recto para manipular a través del cuello uterino. El tamaño del catéter varía según el tamaño corporal. Es importante humedecer el estilete con agua estéril o solución salina (NaCl al 0,9 %) antes de introducirlo en el catéter para facilitar su extracción del catéter después de su colocación en el útero.
Una vez dentro del útero, el catéter se introduce más allá del cuerpo uterino hasta que se localiza en el primer tercio de uno de los cuernos uterinos; se retira la varilla del interior del catéter y el manguito se infla con 15-20 mL de aire, según el tamaño del cuerno uterino, que varía según la raza, edad, paridad, etc.
Cada cuerno uterino se lava con un medio de lavado comercialmente disponible, completo y listo para usar; estas soluciones de lavado de embriones también contienen antibióticos y albúmina sérica bovina como fuente de proteína. Algunas preparaciones comerciales de medios de lavado completos también contienen tensioactivos para minimizar la formación de espuma y burbujas en la placa de búsqueda de embriones. En el pasado, los medios de lavado tenían que prepararse para cada recogida y consistían principalmente en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco con antimicrobianos añadidos y suero fetal bovino al 1 % (SFB) o suero bovino de ternero (o, alternativamente, albúmina sérica bovina al 0,1 %); en todo el mundo, muchos lavados todavía se preparan de esta manera.
El cuerno uterino puede lavarse mediante irrigaciones repetidas de pequeños volúmenes (25-50 mL) de medios de lavado que se dejan drenar en un filtro embrionario. Como alternativa, el cuerno uterino puede lavarse continuamente; por lo general, para lavar el útero de una vaca se usan 1-2 L de medio de lavado.
Una vez completada la irrigación, se desinfla el manguito permitiendo que el contenido del catéter fluya cuidadosamente hacia el filtro embrionario que está situado al final del tubo de salida.
El filtro de embriones se lleva entonces al laboratorio, y su contenido se distribuye en un plato de búsqueda con rejilla y se visualiza usando un estereoscopio (microscopio de disección) a ×10 aumentos.
Todos los embriones se transfieren a una placa limpia (con pocillos) que contiene un medio de retención de composición similar al medio de lavado, excepto por una mayor concentración de SFB/suero de ternero (10-20 %) o albúmina sérica bovina (0,4 %). Al igual que con los medios de lavado, los medios de retención completos también están disponibles comercialmente. Los embriones se visualizan a gran aumento (×40-60) y se clasifican de acuerdo con su morfología, estadio de desarrollo (ovocitos no fertilizados, mórula temprana, mórula apretada, blastocisto, blastocisto expandido, blastocisto eclosionado, etc.) y calidad (excelente, bueno, regular, malo o degenerado). La puntuación de calidad se basa en la evaluación morfológica de la integridad física de los embriones y de las características morfológicas de acuerdo con el estadio de desarrollo embrionario, el estado de compactación, el color del citoplasma, las áreas de degeneración celular, el número de blastómeros extruidos, el tamaño del espacio perivitelino y el tamaño y esfericidad del embrión.
Solo se deben transferir los embriones clasificados como regulares, buenos o excelentes. Los embriones, después de haberse lavado al menos tres veces, se mantienen en un medio de retención. El lavado de los embriones se realiza transfiriendo los embriones a diferentes pocillos de una placa limpia que contiene medios de retención. Este procedimiento, recomendado por la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones, ayuda a eliminar los restos celulares y los patógenos potenciales adheridos a la zona pelúcida. Los embriones se mantienen en medios de conservación a temperatura ambiente hasta que se transfieren a las receptoras o se preparan para su congelación, bisección (división) o sexado embrionario. Como alternativa, los embriones pueden mantenerse refrigerados en un medio de transferencia hasta 24 h sin pérdida apreciable de viabilidad. Algunas empresas de transferencia de embriones realizan la división de los embriones en mitades iguales mediante microcirugía. El número de embriones para transferir puede incrementarse al doble con solo una pequeña reducción en las tasas de gestación. Sin embargo, las técnicas de congelación de los embriones manipulados necesitan mejorarse.
Desde 1978, el método de elección más usual para transferir embriones de ganado bovino a receptoras sincronizadas es a través de técnicas no quirúrgicas. El embrión se carga en una pequeña pajuela de plástico (0,25 mL) colocada en un catéter específico para transferencia de embriones (tipo Cassou). El catéter de transferencia, que está protegido por una funda de plástico estéril desechable para evitar la contaminación perineal y vaginal, se introduce en la vagina. El catéter, ayudado por palpación rectal, se pasa a través del cérvix y se lleva hasta el cuerno uterino ipsilateral al cuerpo lúteo. A continuación, el contenido de la pajuela se deposita en la zona más craneal del cuerno uterino, con cuidado y evitando una manipulación prolongada e innecesaria.
Aunque se pueden obtener mayores tasas de gestación con la transferencia de múltiples embriones, esta técnica no se aconseja porque hay riesgo de distocia y retención de membranas fetales asociado con gestaciones gemelares y una mayor probabilidad de producir terneras con el síndrome freemartin. El uso de semen sexado en los programas de transferencia de embriones se considera viable económicamente, especialmente si se presta atención a la inseminación de las vacas donantes con un número de espermatozoides comparable al utilizado en inseminación artificial con semen convencional no clasificado.
