Kits de pruebas serológicas

La prueba serológica para detectar el virus de la leucemia felina (FeLV) es importante para identificar a los animales infectados y prevenir la transmisión del virus ( ver Virus de la leucemia felina). Se recomienda realizar la prueba antes de la vacunación frente al FeLV, ya que la vacunación en los gatos infectados no limitará el desarrollo o la transmisión de la enfermedad. La mayoría de los kits de diagnóstico internos disponibles en la actualidad están diseñados para detectar la proteína soluble p27 gag específica del FeLV, y que se produce en grandes cantidades durante la viremia. El tiempo entre la infección y la presencia de antígenos detectables varía, pero suele ser de 28-30 días. La vacunación contra el FeLV no arrojará resultados positivos con las pruebas de antígenos, ni la presencia de anticuerpos de origen materno en los gatitos. Las muestras de suero, plasma o sangre completa son más fiables que las de saliva o lágrimas. La mayoría de los kits para la detección poseen controles positivos y negativos incorporados, por lo que se pueden detectar problemas técnicos al realizar la prueba.

Un resultado negativo en una prueba de cribado es muy fiable; sin embargo, pueden producirse resultados falsos positivos con las pruebas de antígeno soluble, especialmente en poblaciones felinas con baja incidencia de la enfermedad. Un verdadero resultado positivo puede reflejar una viremia transitoria o persistente, por lo que las decisiones clínicas no deben basarse en un único resultado. La confirmación de los resultados positivos, especialmente en gatos asintomáticos, debe realizarse mediante pruebas adicionales, como la prueba de antígenos solubles, utilizando un kit de otro fabricante o inmunofluorescencia en sangre o médula ósea. Los gatos con resultados discordantes deben volver a testarse utilizando ambos métodos a los 60 días, y han de considerarse potencialmente infecciosos hasta la confirmación del resultado.

A algunos gatos de los que se pensaba que habían pasado la infección se les identificó mediante técnicas de PCR a tiempo real, método muy sensible para detectar ADN proviral o ARN viral del FeLV asociado a células. Estos gatos con ADN proviral positivo pero antígeno del FeLV negativo es poco probable que eliminen virus o desarrollen la enfermedad clínica. Sin embargo, el FeLV proviral podría transmitirse en transfusiones de sangre, por lo que los posibles donantes de sangre deberían ser PCR negativos para el FeLV.

Debido a que la concentración de antígeno del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) en sangre de los gatos infectados suele ser muy baja, las pruebas de diagnóstico están diseñadas para detectar anticuerpos anti-FIV en lugar de antígenos. Los kits de prueba dan un resultado positivo o negativo para el anticuerpo en lugar de un título. Los anticuerpos suelen desarrollarse en los siguientes 60 días después de la infección, pero este periodo es bastante variable, y algunos gatos infectados no desarrollan anticuerpos detectables. Una vez presentes, los anticuerpos al parecer permanecen durante >2 años, excepto los detectables transitoriamente en gatitos que tienen anticuerpos de origen materno. Por esta razón, un gatito <6 meses de edad que dé positivo en la prueba debe volver a testarse después de los 6 meses. Si la prueba sigue siendo positiva, lo más probable es que el gatito esté infectado.

Los kits de ELISA disponibles actualmente presentan una elevada sensibilidad. Sin embargo, estas pruebas no pueden distinguir entre los anticuerpos producidos en respuesta a la vacunación frente al FIV y los producidos por una infección natural. Se ha desarrollado una prueba de ELISA que parece discriminar con éxito entre los anticuerpos producidos en respuesta a la vacunación y los producidos en infecciones naturales, aunque no está disponible para uso comercial. Un enfoque razonable sería utilizar una prueba de detección. Un resultado negativo es un indicador bastante fiable de que el gato no está infectado. Los resultados positivos, especialmente en gatos asintomáticos, deben confirmarse con otra prueba como el Western blot, si está disponible. Los gatitos nacidos de madres vacunadas tienen anticuerpos durante un periodo de tiempo variable.

Los kits de prueba de ELISA e inmunomigración están disponibles para la detección del antígeno del parvovirus canino (CPV) en heces. Estas pruebas son bastante específicas para el virus, pero los perros que se han vacunado recientemente pueden eliminar de forma transitoria los antígenos previamente detectados. La sensibilidad es algo menor por varias razones. La excreción fecal se produce solo durante ~7-10 días, y comienza el día 3-5 tras la exposición, por lo que el virus no siempre es detectable en perros con signos clínicos. La sangre en heces, así como la formación de complejos antígeno-anticuerpo en sangre o exudados presentes en el intestino, pueden dar resultados falsos negativos. Parece que los kits para uso clínico pueden tener una sensibilidad reducida a la nueva cepa CPV2c.

En los gatos, aunque estos kits no están autorizados, varios estudios han demostrado que pueden utilizarse para detectar el virus de la panleucopenia en las heces. Se desconoce la especificidad y la sensibilidad. Algunos gatos dan positivo después de la vacunación, incluso cuando se utilizan vacunas con virus inactivados.

Mediante el análisis secuencial de anticuerpos anti-CPV puede valorarse la necesidad de revacunación y las posibles interferencias con anticuerpos maternos. Estas pruebas no están destinadas a diagnosticar la infección por CPV y no distinguen entre los anticuerpos vacunales y los producidos por exposición natural. Los kits disponibles actualmente incluyen ELISA y pruebas inmunocromatográficas. Estos métodos son semicuantitativos, y para determinar los niveles relativos de anticuerpos utilizan cambios de color en las muestras que se van a analizar frente a los pocillos de control positivo. El nivel de anticuerpos anti-CPV protector contra la infección no se conoce, pero los resultados se interpretan basándose en los títulos protectores determinados por otros métodos. La PCR está ampliamente disponible para la detección del virus en las heces.

Hay disponibles kits para la determinación de anticuerpos contra el virus del moquillo canino, en combinación con pruebas de anticuerpos frente al vacuna del moquillo canino. Estas pruebas son ELISA semicuantitativas para detectar IgG anti-moquillo canino en suero o plasma. Se pueden utilizar para evaluar la necesidad de revacunación y para determinar los niveles de anticuerpos maternos presentes en cachorros. Son menos útiles para el diagnóstico de la infección por virus del moquillo canino. Se ha desarrollado una prueba basada en inmunocromatografía para la detección del antígeno del virus del moquillo canino que posee una buena sensibilidad y especificidad, especialmente cuando se emplean hisopos conjuntivales. La sensibilidad y la especificidad son algo menores en la sangre y en los hisopos nasales. Este ensayo no está disponible actualmente como un kit para uso en la clínica.

La enfermedad de Lyme ( ver Borreliosis de Lyme) está causada por la espiroqueta B burgdorferi transmitida por garrapatas. En general, las pruebas de diagnóstico para esta infección presentan varios problemas que incluyen niveles relativamente altos de resultados positivos en animales clínicamente sanos, persistencia de anticuerpos después de la resolución clínica de la enfermedad, interpretación de los títulos de anticuerpos en perros vacunados y el hecho de que los anticuerpos pueden no ser detectables hasta las 4-6 semanas tras la exposición. En la clínica, está disponible un kit de ELISA para la detección de anticuerpos anti-B burgdorferi en suero o plasma que minimiza algunos de estos problemas, ya que utiliza un péptido sintético (C₆) basado en una proteína específica conservada de B burgdorferi. Esta proteína es importante para inducir una respuesta inmunitaria humoral 3-5 semanas después de la infección natural en perros. La vacunación no induce una respuesta inmunitaria de reacción cruzada a este antígeno, por lo que las técnicas que utilizan la proteína C₆ pueden distinguir los anticuerpos inducidos por la vacuna de los producidos en respuesta a infecciones naturales. Los ensayos basados en la proteína C₆ también son más específicos que las pruebas anteriores, porque no hay reactividad cruzada con otros agentes transmitidos por garrapatas o con anticuerpos autoinmunes.

Existe una prueba actualmente disponible a nivel clínico para detectar anticuerpos anti-B burgdorferi, si bien se trata de una técnica cualitativa que solo especifica si el resultado es positivo o negativo. Aunque está autorizado para perros, este kit también se ha validado para gatos y caballos. Los métodos cuantitativos utilizados en laboratorios de referencia pueden usarse para monitorear la eficacia del tratamiento (es decir, detección de títulos de anticuerpos decrecientes), pero estos resultados no siempre son concluyentes.

La ehrlichiosis canina ( ver Ehrlichiosis, anaplasmosis e infecciones relacionadas en animales) es una enfermedad transmitida por garrapatas, causada por una de varias especies de Ehrlichia. Puede asociarse con trombocitopenia, anemia y neutropenia, así como con otros signos clínicos inespecíficos. Aunque la identificación de las mórulas de Ehrlichia en leucocitos puede ser diagnóstica de esta infección, el análisis serológico para la detección de anticuerpos es más común y presenta mayor sensibilidad. Las pruebas internas para la ehrlichiosis son cualitativas (dan solo un resultado positivo o negativo) o semicuantitativas para detectar anticuerpos frente a E canis. La que esta disponible actualmente es la prueba de ELISA para realizar en suero, plasma o sangre completa. Los kits utilizan análogos recombinantes de las principales proteínas de la membrana externa de E canis o proteínas completas de E canis como antígeno. Las diferentes especies de Ehrlichia estimulan los anticuerpos, que parecen presentar una reacción cruzada en estos ensayos. Debido a que los anticuerpos anti-E canis pueden tener una vida media muy larga y estar presentes en infecciones subclínicas, su detección no distingue entre la exposición y la presencia de la enfermedad por Ehrlichia, de forma que el éxito de la respuesta a la terapia no se puede indicar.

B canis no es un problema en algunos países y las pruebas no están siempre disponibles. Sin embargo, la infección puede ser subclínica o puede causar diversos signos clínicos, como aborto, infertilidad y discoespondilitis ( ver Brucelosis en perros). La infección se da con mayor frecuencia durante el apareamiento; por tanto, la detección de animales reproductores es importante para la prevención de la enfermedad. Se encuentra disponible un kit de diagnóstico rápido basado en aglutinación en portaobjetos que incluye un paso de 2-mercaptoetanol (2-ME) que reduce los resultados falsos positivos al eliminar las reacciones inespecíficas de la IgM. Este ensayo detecta anticuerpos séricos frente a los antígenos de superficie de la bacteria. Los informes de sensibilidad y especificidad de esta técnica varían según la prueba de confirmación utilizada. Se han desarrollado técnicas de ELISA e inmunocromatográfía para la detección cualitativa y semicuantitativa de anticuerpos anti-B canis. Los resultados positivos obtenidos con cualquiera de estos métodos deben confirmarse mediante PCR o hemocultivo.

Las pruebas serológicas para el antígeno de D immitis en los perros son más sensibles que la detección de microfilaremia y, además, pueden detectar infecciones ocultas. El antígeno del gusano del corazón se detecta por primera vez ~5 meses después de la infección y suele preceder algunas semanas a la microfilaremia. Sin embargo, este periodo de tiempo puede adelantarse en animales tratados con preventivos como la lactona macrocíclica y en aquellos que presentan pocos gusanos. Los formatos de pruebas de antígeno disponibles incluyen ELISA y ensayos inmunocromatográficos. Se puede usar suero o plasma en todos los kits, y en algunos puede emplearse sangre completa. Algunos kits se pueden almacenar a temperatura ambiente, mientras que otros deben refrigerarse y llevarse a temperatura ambiente antes de su uso. Se hallan disponibles pruebas individuales y por lotes. Todos los kits tienen una especificidad muy alta. Los resultados falsos positivos suelen deberse a problemas técnicos, como un lavado inadecuado o la no realización de la lectura de los resultados en el momento óptimo. Se deben seguir estrictamente las instrucciones del fabricante en cualquiera de los formatos de las pruebas.

La sensibilidad varía de una prueba a otra y se ve afectada por la carga de gusanos, el género del gusano (se detecta un antígeno hembra, por tanto, las infecciones únicamente masculinas no se detectarán) y la madurez de los gusanos hembra. Ninguna de estas pruebas tiene una sensibilidad del 100 %. Cuando se obtienen resultados inesperados falsos en una prueba de antígeno, se recomienda realizar pruebas adicionales de diferente formato.

Después del tratamiento adulticida, la antigenemia debería volverse indetectable a los 6 meses. Sin embargo, algunos gusanos del corazón adultos pueden tardar más de un mes en morir, por lo que una prueba de antígeno positiva 5-6 meses después del tratamiento no indicaría necesariamente el fracaso del tratamiento. La prueba debe repetirse 2-3 meses después.

La enfermedad del gusano del corazón en los gatos es sustancialmente diferente a la de los perros y, en consecuencia, las recomendaciones para las pruebas serológicas son diferentes. Los gatos suelen tener una carga parasitaria muy inferior: a menudo hay solo uno o dos gusanos. Los gatos también tienen infecciones de un solo sexo con más frecuencia que los perros. La microfilaremia circulante es rara en los gatos y las microfilarias tienen una vida más corta. Estas diferencias a menudo se atribuyen a una respuesta inmunitaria felina más eficaz frente a la infección por dirofilariosis. Sin embargo, los gusanos del corazón pueden causar enfermedades graves en los gatos.

Las pruebas de detección de antígeno del gusano del corazón son menos sensibles para la detección de infecciones en gatos que en perros, con una sensibilidad documentada del 50-80 %. Por tanto, una prueba de antígeno negativa no excluye la infección por dirofilariosis. Las pruebas de detección de anticuerpos también se encuentra disponible, pero la presencia de anticuerpos no confirma la dirofilariosis felina. La exposición transitoria a las larvas estimulará la producción de anticuerpos, si bien muchas infecciones tempranas se eliminan espontáneamente y los gusanos adultos nunca llegan a desarrollarse. Una combinación de pruebas tanto para el antígeno como para el anticuerpo frente al D immitis elevan la sensibilidad y la especificidad muy por encima de la que proporciona cualquier método por separado. Las pruebas combinadas están justificadas en gatos con signos clínicos de dirofilariosis cuando los resultados de una de las dos pruebas no sea concluyente.

Los kits para la detección del antígeno y del anticuerpo frente a D immitis en gatos se comercializan en varios formatos. Estos kits pueden realizarse con plasma o suero, y son cualitativos o semicuantitativos.

La única hormona específica de la gestación en la perra y la gata es la relaxina, que la produce la placenta una vez implantado el óvulo fertilizado. La relaxina se detecta por primera vez en el plasma alrededor del día 20-25 después de la fertilización. No está presente en perras con pseudogestación o no preñadas. Los niveles de relaxina alcanzan su punto máximo alrededor del día 40-50 de gestación y disminuyen en el parto, aunque se pueden detectar hasta los 50 días de lactación. Los kits para determinar la relaxina incluyen ELISA de micropocillos e inmunomigración cualitativa, que requieren suero, plasma o sangre completa. Los ensayos parecen tener muy buena especificidad, es decir, no se encuentran niveles detectables de relaxina en animales ingrávidos. Se han documentado resultados falsos negativos en algunas perras con camadas muy pequeñas o en aquellas con uno o más cachorros no viables.

En la perra, la hormona luteinizante (LH) sérica normalmente está presente en niveles muy bajos excepto justo antes de la ovulación, cuando sufre un incremento drástico. La ovulación se produce 2 días después del pico de LH, y regresa al valor inicial las 24-40 h posteriores. Los niveles de progesterona sérica comienzan a aumentar en el momento del pico de LH. Una perra será fértil a los 4-7 días después del pico de LH, sobre todo los días 5 y 6. Además, el pico de LH determina el periodo de gestación, y el parto se produce entre los días 64 y 66 después del pico. El pico de LH puede darse desde 3 días antes hasta 5 días después del inicio de la conducta estral, por lo que no puede predecirse de manera fiable mediante la conducta.

El momento de la ovulación a través de la medición de la LH requiere pruebas diarias, que por lo general comienzan cuando >50 % de las células epiteliales vaginales están cornificadas, mediante citología vaginal. Ocasionalmente, puede producirse un falso pico de LH no seguido de ovulación ni de aumento de progesterona. Por esa razón, se recomienda determinar la LH y la progesterona para una detección más precisa de la ovulación. Un aumento de la concentración de LH no seguido de un incremento de los niveles de progesterona se considera una fluctuación del proestro, por lo que las pruebas de ovulación deben continuar.

Está disponible un kit esencialmente cualitativo en la clínica para medir las concentraciones de LH en suero; un nivel sérico de LH <1 ng/mL se interpreta como negativo, y >1 ng/mL se considera positivo. La prueba es un ensayo inmunocromatográfico.

Las perras y las gatas ovariectomizadas presentan concentraciones séricas de LH >1 ng/mL. Debido a que esta concentración de LH también se observa en perras enteras a punto de ovular, una sola concentración alta de LH no confirma el estado reproductivo, si bien una concentración baja indica que la hembra no está ovariectomizada.

La progesterona sérica comienza a aumentar tras el pico de LH con un incremento modesto el día antes de la ovulación y otro adicional a 4-10 ng/mL el día de la ovulación. La progesterona continúa aumentando y permanece incrementada durante la gestación o el diestro. Como el aumento de progesterona es más constante que el de LH, no es necesario realizar pruebas diarias. Se recomienda que las pruebas comiencen en el proestro tardío y continúen cada 2-3 días hasta que se alcance un nivel alto que indique la ovulación.

Los kits para la determinación de progesterona en la clínica son del tipo ELISA semicuantitativo con concentraciones preovulatorias designadas de acuerdo al kit utilizado. Algunos kits están diseñados para proporcionar dos rangos de progesterona adicionales (intermedio y alto), mientras que otros indican solo niveles preovulatorios y de "día ovulatorio o posterior". En comparación con otros métodos, los kits rápidos son menos precisos, particularmente en el rango de aproximadamente 1,5-10 ng/mL, que es el rango de interés para la detección temprana de la ovulación. La precisión es mayor a niveles más altos de progesterona. Como se ha mencionado anteriormente, se recomienda la medición tanto de la LH como de la progesterona para un manejo reproductivo más preciso.

El análisis de la tiroxina (T₄) sérica total puede utilizarse para la detección del hipotiroidismo canino o como prueba de diagnóstico del hipertiroidismo felino. (También ver La glándula tiroides.) Además, las concentraciones de T₄ se miden cuando se monitorea la terapia para el hipo- o hipertiroidismo. Un kit de análisis ELISA, que utiliza un instrumento adicional para leer los resultados, proporciona información semicuantitativa sobre la concentración de T₄ en sueros caninos y felinos. El análisis se ejecuta en uno de dos “rangos dinámicos”, según el rango de resultados previsto. Los estudios publicados que comparan este ensayo con otros métodos de análisis para la T₄ varían en sus conclusiones. Se recomienda medir periódicamente las concentraciones de T₄ en muestras combinadas de suero de gatos y perros para valorar si el método es consistente. Probablemente sea aún mejor utilizar un laboratorio comercial para la medición de tiroxina.

El 99 % de la T₄ se encuentra unido a proteínas en la sangre, por tanto, no es biológicamente exacto. Los niveles de T₄ libre son una prueba más precisa de función tiroidea en gatos y perros.

La medición de la concentración de IgG en el suero del potro durante las primeras 24 h después del nacimiento puede ser útil para prevenir el fallo de transferencia de inmunidad pasiva de IgG en el calostro de la yegua. El uso de procedimientos diagnósticos en el potro puede facilitar el rápido diagnóstico y tratamiento. Un nivel de IgG en suero del potro >800 mg/dL se suele considerar óptimo, y niveles <200 mg/dL indican fracaso de la transferencia pasiva. Las concentraciones de 200-800 mg/dL se cree que son una evidencia de transferencia parcial.

Aunque la inmunodifusión radial se considera el método más preciso para la detección de IgG, lleva más tiempo (5-24 h) que muchos otros métodos y, por tanto, no es tan útil como indicador de la necesidad de una intervención terapéutica. Las pruebas de detección más rápidas incluyen la prueba de turbidez con sulfato de zinc, la de precipitación con glutaraldehído y los kits de ELISA.

La prueba de sulfato de zinc estima la IgG en suero basándose en su precipitación cuando se añade a una solución que contiene zinc. La turbidez suele ser vuelve visible cuando los niveles de IgG son de 400-500 mg/dL. Esta prueba dura ~1 h y se puede realizar con soluciones de sulfato de zinc elaboradas en la clínica, o se pueden comprar reactivos para la prueba o un kit de análisis.

La prueba de precipitación con glutaraldehído requiere la adición de 1 volumen de suero a 10 volúmenes de glutaraldehído al 10 % y el examen de los tubos a intervalos cronometrados de hasta 60 min. La presencia de IgG en el suero hace que se forme un precipitado sólido en el tubo. La formación de coágulos en <10 min se suele correlacionar con una concentración de IgG >800 mg/dL, mientras que una reacción positiva en los siguientes 60 min se interpreta como una concentración de IgG >400 mg/dL. Ambos métodos utilizan suero, en lugar de plasma, por lo que el tiempo para que la sangre se coagule y la separación del suero se debe agregar al tiempo necesario para realizar la prueba.

Los kits de ELISA para análisis rápidos en el potro pueden necesitar suero o sangre completa y requerir un tiempo de ~10 min. La mayoría de los métodos son semicuantitativos basados en cambios de color que corresponden a concentraciones de IgG <400 mg/dL, de 400-800 mg/dL o >800 mg/dL. Actualmente se encuentra disponible un inmunoensayo colorimétrico cuantitativo.

Los informes de sensibilidad y especificidad varían entre estos métodos. En general, la sensibilidad para identificar potros con concentraciones de IgG <400 mg/dL parece ser aceptable para todos los métodos. Por tanto, habrían pocos potros con fallo de transferencia pasiva que no fuesen identificados por estos métodos. La especificidad es menos aceptable para algunos de los métodos, y la necesidad de tratamiento en el potro podría instituirse en función de los resultados.

La medición de la concentración de IgG en el suero del ternero neonato es importante por las mismas razones descritas para el potro. Sin embargo, los niveles de IgG en terneros son diferentes a los de los potros: niveles >1000 mg/dL se consideran una transferencia pasiva adecuada y <1000 mg/dL indican un fallo de transferencia pasiva de inmunidad. La inmunodifusión radial es la técnica de referencia para la medición de la IgG sérica en los terneros (como en los potros), pero el tiempo requerido para la realización de este ensayo lo hace menos útil que otros métodos. Otros métodos incluyen pruebas de turbidez de sulfato de zinc y sulfito de sodio, precipitación con glutaraldehído, medición de sólidos séricos totales por refractometría y kit de ELISA de flujo lateral.

Las pruebas de turbidez de sulfito de sodio y sulfato de zinc se basan en la precipitación de proteínas de alto peso molecular en esas soluciones. Para la realización de la prueba se utiliza suero como muestra, se incuba durante 15-30 min y se procede a la lectura. Los resultados de estas pruebas varían en sensibilidad y especificidad según el criterio de valoración elegido, y las dificultades técnicas con los reactivos pueden disminuir el beneficio de la técnica. La prueba de precipitación con glutaraldehído se realiza como en los potros; si no hay formación de coágulo a los 60 min, sería indicativo de fallo de transferencia pasiva de inmunidad.

La medición de la proteína total sérica por refractometría es un indicador bastante fiable de una adecuada transferencia pasiva en terneros sanos y bien hidratados. Un nivel de proteínas de 5,2 g/dL equivale aproximadamente a una concentración de IgG de 1000 mg/dL.

Existe un kit de ELISA disponible comercialmente que utiliza suero como muestra y tarda ~20 min en realizar la lectura. El ensayo es cualitativo, ya que indica una concentración de IgG >1000 mg/dL o <1000 mg/dL. La sensibilidad y la especificidad son razonablemente buenas, y se ve menos influenciado por el estado de hidratación en el ternero o la estabilidad de los reactivos que otros métodos. Se deben seguir las recomendaciones del fabricante para almacenar y usar los kits.