Toma y envío de muestras de animales al laboratorio

El envío de muestras biológicas debe cumplir con los protocolos establecidos por el servicio de mensajería o envío utilizado. En algunos casos, el transporte aéreo requiere el cumplimiento de las regulaciones de la Asociación Internacional de Transporte Aéreo sobre materiales peligrosos. Estas regulaciones incluyen restricciones sobre el volumen de formol que se puede enviar en un contenedor (<1 L en total y <30 mL por frasco) e indican que los envíos con muestras de tejido fresco deben estar claramente etiquetados como Sustancia Biológica de Categoría B. Si se sospechan enfermedades de alto riesgo, es esencial ponerse en contacto con las agencias veterinarias estatales y/o federales respecto a las precauciones necesarias para el envío. Se pueden encontrar más detalles en el sitio web de la Asociación Internacional de Transporte Aéreo y del US Postal Service Postal Explorer, así como en sitios web de mensajería comercial.

Un enfoque fundamental es diseñar una barrera de tres capas para proteger la muestra. La muestra se coloca en un contenedor primario apropiado (frasco/bolsa/tubo sellado). Luego se cierra en un recipiente secundario, que incluye algo de material adsorbente. Hay que tener en cuenta que los artículos como jeringas, guantes obstétricos y recipientes sin orificios sellables no son adecuados para el envío. Las muestras líquidas no deben enviarse en bolsas de plástico, ha de usarse un frasco con cierre hermético. Se deben utilizar rotuladores a prueba de agua al etiquetar estas muestras y contenedores; el contenido y la identificación del paciente son informaciones cruciales.

El contenedor secundario se coloca en la caja de envío (contenedor terciario), que a menudo alberga paquetes de refrigerante, así como varios materiales de amortiguación (p. ej., espuma de poliestireno) para proteger la muestra. Los materiales refrigerantes deben sellarse en bolsas de plástico para evitar daños por condensación. Los paquetes de refrigerante no han de colocarse directamente sobre muestras, como los tubos de sangre completa, que podrían sufrir efectos adversos si se congelan durante el transporte. Hay que asegurarse de incluir el formulario de envío debidamente protegido. Lo ideal es que el contenedor terciario sea una caja de poliestireno resistente o una caja de cartón forrada con un revestimiento de poliestireno ajustado. Si se usa hielo seco, esto debe anotarse en la etiqueta de la caja de cartón y la tapa no debe sellarse con cinta. De lo contrario, el CO₂ liberado del hielo seco podría aumentar la presión y dañar el paquete o su contenido.

Los tejidos para examen microscópico recogidos mediante biopsia o durante la necropsia pueden ser fundamentales para obtener un diagnóstico. El uso de esta técnica diagnóstica relativamente rápida y barata puede producir con frecuencia un ahorro sustancial de tiempo, dinero y vidas de animales. El creciente número de pruebas inmunohistoquímicas que se pueden aplicar al tejido fijado en formol ha reforzado la utilidad de esta técnica de diagnóstico.

Por lo general, los tejidos autolisados no sirven para el examen histopatológico. El examen rápido de necropsia y la toma de muestra de órganos son fundamentales. Los tejidos no deben congelarse antes de la fijación. Aparte de los tejidos del SNC (véase más adelante), las muestras recolectadas para histología nunca deben tener un grosor >1 cm (preferiblemente 5-7 mm) y deben colocarse inmediatamente en una solución que contenga ≥10 veces su volumen de formol al 10 % tamponada con fosfato para garantizar su adecuada fijación.

Los tejidos recolectados para el examen histológico deben ser representativos de cualquier lesión presente y, en el caso de lesiones cutáneas mediante punch (o sacabocados) y biopsias obtenidas mediante recolección endoscópica deben centrarse directamente en las lesiones macroscópicas visibles. Las biopsias en cuña o las muestras de tejido recogidas en la necropsia deben incluir parte del tejido circundante aparentemente normal; la interfaz entre lo normal y lo anormal puede proporcionar información clave. Las biopsias por escisión de tumores pequeños (<1,5 cm) pueden cortarse por la mitad. Los tumores más grandes se pueden cortar como el pan, para que el formol pueda penetrar en la cara de cada rebanada. Alternativamente, se pueden recolectar varias muestras representativas (de 7 mm de ancho, incluyendo la interfaz de normal y anormal).

En lugar de enviar grandes volúmenes de formol, las muestras de tejido pueden fijarse internamente durante al menos 24 horas en un volumen apropiado y luego transferirse a un volumen más pequeño de formol fresco para su envío. La fijación prolongada puede afectar negativamente a las pruebas de inmunohistoquímica, por lo que las muestras deben enviarse con prontitud si se anticipan las pruebas de inmunohistoquímica. Las muestras histológicas se deben enviar en contenedores irrompibles y embalarse de forma que se eviten derrames o congelaciones durante el transporte.

Los tejidos específicos recogidos en la necropsia requieren atención adicional. Dado que la mucosa GI se descompone rápidamente, las secciones cortas del intestino recolectadas en la necropsia deben abrirse longitudinalmente para permitir una fijación adecuada. Si se va a someter la médula espinal, la duramadre debe cortarse cuidadosamente a lo largo para permitir una penetración más rápida en la médula.

La fijación del cerebro plantea un dilema especial, especialmente si no se pudo determinar ante mortem la localización neuroanatómica de la lesión o lesiones dentro del órgano. Idealmente, se requiere un cerebro completo, intacto y fijo para un análisis histopatológico completo. Para fijar adecuadamente una muestra de este tipo se necesita sumergir el cerebro durante muchos días en un volumen muy grande de formol, por lo que los cerebros suelen transportarse en un estado solo parcialmente fijo. Si la muestra puede enviarse durante la noche, puede ser aceptable enviar un cerebro refrigerado, cuidadosamente empaquetado y sin fijar, que luego puede procesarse en el laboratorio de diagnóstico. A menudo, el cerebro se divide por la mitad longitudinalmente y la otra mitad se envía sin fijar (en fresco) debidamente refrigerada para las pruebas microbiológicas, mientras que la otra mitad se fija parcialmente en tránsito. Este método puede resultar insatisfactorio si se trata de una lesión unilateral solitaria. Cortar el cerebro a la anchura adecuada para una rápida fijación provoca considerables artefactos de fijación y debe evitarse en la medida de lo posible; es preferible fijar el cerebro intacto/partido en un gran volumen de formol durante >24 horas.

Cualquier agente específico de interés en la investigación diagnóstica debe mencionarse en el formulario de presentación. Algunos agentes tienen requisitos (p. ej., cultivo anaerobio, medios especiales) que no se utilizarían en la mayoría de los laboratorios a menos que se cite el patógeno como diagnóstico diferencial. Las técnicas de laboratorio y las capacidades para el examen microbiológico varían, pero la mayoría de las pruebas se basan en el crecimiento/visualización de microorganismos viables intactos o en la detección de ácidos nucleicos y proteínas de estos patógenos. Por lo tanto, las muestras no fijadas (tejido, líquido, etc,) deben recolectarse asépticamente y enviarse con prontitud para evitar su degradación.

Si se van a realizar pruebas de PCR, es particularmente importante evitar la contaminación cruzada entre varios animales en una presentación; esto se aplica a tejidos, fluidos e incluso a instrumentos de disección. Además, los hisopos destinados al análisis de PCR no deben colocarse en medios de transporte de agar o carbón. Deben evitarse los hisopos de alginato de calcio. En su lugar, los hisopos de algodón o dacrón deben enviarse en un tubo con unas gotas de solución salina estéril o medio de transporte viral.

Algunos protocolos de análisis pueden permitir la combinación de muestras de órganos de un individuo, pero para la gran mayoría, es preferible que cada tejido se recoja en bolsas o tubos separados, estériles y claramente etiquetados para su envío. Las muestras intestinales nunca deben mezclarse en un recipiente con otras muestras de tejido. Las muestras de tejidos y fluidos para la mayoría de ensayos microbiológicos pueden congelarse antes del envío, pero la congelación no suele ser conveniente si las muestras pueden enfriarse y entregarse directamente al laboratorio en las 24 horas siguientes a la colección. Las excepciones a esta regla incluyen el análisis de ciertas toxinas, como las de Clostridium perfringens y C botulinum, en el que la degradación de la toxina debe prevenirse mediante una rápida congelación después de la recogida. Se debe proporcionar refrigerante adecuado para que se mantengan frías (o congeladas) hasta que lleguen al laboratorio.

Las muestras fecales para pruebas de parasitología han de enviarse refrigeradas en recipientes debidamente sellados. La congelación puede tener poco impacto en las pruebas rutinarias de flotación o sedimentación, pero anulará la posibilidad del análisis de Baermann para las larvas de nematodos. Los ectoparásitos o nematodos que se presenten para su identificación deben enviarse en viales que contengan un 70 % de alcohol.

Si se sospecha una toxina conocida, siempre se debe solicitar un análisis específico, ya que los laboratorios no pueden simplemente "verificar si hay intoxicación". Una descripción completa de los hallazgos clínicos y epidemiológicos puede ayudar a diferenciar el envenenamiento de las enfermedades infecciosas que puedan simular el envenenamiento.

Las principales muestras que deben recogerse suelen ser:

• Contenido del estómago.

• Hígado.

• Riñón.

• Sangre completa.

• Plasma/suero.

• Orina.

• Algunas excepciones, como el tejido cerebral para el análisis de colinesterasa.

Para algunas investigaciones, el diagnóstico requiere el análisis del alimento o agua. Si hay dudas sobre los procedimientos de remisión de muestras, se debe contactar con el laboratorio.

La congelación es fundamental para prevenir la degradación de solo unos pocos analitos, como la colinesterasa, el fosfuro de zinc y el fluoroacetato de sodio (compuesto 1080). Para la mayoría de los analitos, será suficiente el envío nocturno de las muestras refrigeradas.

Los contenedores para envasar y transportar muestras deben estar libres de agentes químicos. Los envases de plástico, tanto bolsas como botes, son ideales: se deben evitar los frascos con tapa de metal. Las muestras deben empaquetarse individualmente y todos los recipientes deben etiquetarse.

Si existe la posibilidad de que existan problemas legales, todos los contenedores para el envío han de sellarse para que pueda detectarse la manipulación o llevarlos a mano al laboratorio y obtener un recibo. La cadena de custodia debe documentarse con precisión.

Si se sospecha que el alimento o el agua son la fuente del contaminación, las muestras de tejido han de ir acompañadas de las muestras de tejido refrigeradas y de cualquier etiqueta descriptiva del alimento. Si es posible, se debe enviar una muestra compuesta representativa del lote del alimento o envío sospechoso (es decir, alícuotas de la parte superior, media o inferior del contenedor de alimento).

Los estudios de rutina requieren sangre completa anticoagulada y varios frotis sanguíneos. Los frotis sanguíneos deben prepararse inmediatamente después de la toma de sangre para minimizar el deterioro celular. La sangre anticoagulada ha de refrigerarse, los frotis sanguíneos no. El EDTA es el anticoagulante de elección para un hemograma completo. La sangre para estudios de coagulación debe recogerse en un tubo con tapón azul, que contiene citrato sódico. Después de mezclar, la muestra debe centrifugarse durante 5 minutos, y posteriormente se ha de extraer el plasma y transferirse a un tubo limpio sin anticoagulante. El plasma debe mantenerse congelado hasta el momento del análisis. La sangre completa no ha de congelarse porque esto causa lisis celular y hemólisis macroscópica, que interfieren con la prueba.

La mayoría de las pruebas bioquímicas requieren suero, pero una prueba ocasional puede precisar plasma. Los anticoagulantes presentes en el plasma pueden interferir con las pruebas; por lo tanto, siempre se debe enviar suero, a menos que se solicite explícitamente plasma. Debido a que la lipemia puede interferir con una serie de pruebas químicas, los perros y gatos deben estar en ayunas durante las 12 h previas a la extracción de la muestra.

Para las muestras de suero, estas se deben extraer en un tubo con tapón rojo o en un tubo separador de suero. La muestra debe mantenerse a temperatura ambiente durante 20-30 minutos para permitir la formación y retracción completa del coágulo. La formación incompleta del coágulo puede hacer que el suero gelifique, debido a la formación latente de fibrina. El coágulo debe separarse del tubo pasando suavemente un aplicador por las paredes del tubo ("rimming"). Posteriormente, la muestra debe centrifugarse a alta velocidad (~1000 g; 2200 rpm) durante 10 minutos. La manipulación brusca de la muestra o la separación incompleta de los eritrocitos del suero puede provocar hemólisis, lo que puede interferir en algunas pruebas.

Si la muestra se ha recogido en un tubo separador de suero, la centrifugación hará que se aloje una capa de gel entre las células empaquetadas y el suero. La capa de gel debe inspeccionarse para garantizar la integridad de la barrera, y se recomienda volver a centrifugar si existe una grieta visible en esta capa. Si se ha utilizado un tubo de tapón rojo, el suero debe extraerse y transferirse a un tubo limpio para minimizar artefactos como el descenso de los niveles de glucosa. El suero se debe refrigerar o congelar hasta el momento del análisis. Los retrasos en el análisis pueden afectar negativamente a los resultados de varios analitos.

Por lo general, para los estudios serológicos se necesita suero, pero el plasma resulta con frecuencia satisfactorio. Las muestras deben recogerse de la misma forma que la descrita para las pruebas bioquímicas y siempre deben estar libres de hemólisis. En algunos casos, para poder establecer un diagnóstico correcto, pueden necesitarse muestras pareadas. La muestra de fase aguda debe recogerse de forma precoz en el curso de la enfermedad y congelarse. La muestra de convalecencia se ha de recoger 10-14 días después, y ambas muestras deben enviarse al laboratorio al mismo tiempo.

Los frotis secados con aire suelen ser aceptables. El secado rápido de las extensiones con aire minimiza la distorsión celular, lo que mejora la calidad del diagnóstico. Sin embargo, según el método de tinción utilizado, algunos laboratorios prefieren las extensiones fijadas con alcohol. Las muestras pueden obtenerse por aspiración con aguja fina o mediante raspado. Pueden usarse también improntas (preparaciones de contacto) de lesiones externas, aunque estas suelen tener un mayor grado de contaminación. El material aspirado debería extenderse siempre antes del secado con aire. Las extensiones de líquidos pueden prepararse utilizando una técnica tradicional de extensión de sangre. Los líquidos con alta celularidad pueden extenderse directamente, y los líquidos con baja celularidad deben centrifugarse para poder concentrar las células. El material grueso o el líquido viscoso se extiende más fácilmente usando una técnica de aplastamiento, que consiste en colocar un segundo portaobjetos encima del material aspirado y deslizarlo rápida y suavemente hacia abajo a lo largo del portaobjetos inferior.

Las extensiones de sangre o citológicas nunca deben enviarse por correo al laboratorio en el mismo paquete que los tejidos fijados en formol, porque los vapores de formol producirán confusión en la muestra. Muchos laboratorios ofrecen ahora pruebas inmunocitoquímicas, y se requiere un manejo adecuado de las presentaciones citológicas para obtener resultados fiables. Por lo general, los frotis no fijados secados al aire son suficientes, pero en algunos casos se recomienda el envío de las muestras en tubos que contengan un medio de transporte.

El análisis de líquidos incluye habitualmente la determinación del contenido proteico, un recuento celular total y un examen citológico. Pueden realizarse otras pruebas dependiendo de la fuente o el aspecto (p. ej., líquido quiloso) de la efusión. Se debe recolectar una muestra de derrame/líquido en un tubo con EDTA (tapón morado) para el análisis de rutina. Se ha de recolectar una segunda muestra en un tubo de suero (tapón rojo) si se van a realizar análisis bioquímicos (p. ej., triglicéridos, colesterol, lipasa para derrames quilosos) o si se desea un cultivo bacteriano (p. ej., líquido articular). Estas muestras deben enviarse refrigeradas pero no congeladas.

Las extensiones para el examen citológico (véase anteriormente) han de prepararse a partir de una gota de líquido inmediatamente después de que se haya recolectado la muestra, para minimizar el daño celular y otros artefactos in vitro. Las muestras de LCR deben recogerse en pequeños tubos con EDTA y enviarse inmediatamente con alta prioridad; el valor citológico de las muestras de LCR se degrada rápidamente y la baja celularidad hace que el examen directo del frotis sea poco satisfactorio. Si se dispone de suficiente LCR, entonces una muestra de tubo de tapón rojo puede ser útil para intentos de serología o cultivo.

La orina es otro líquido que sufre una rápida degradación. Por lo general, si la orina no puede llegar al laboratorio dentro de las 12 h siguientes a la recogida, es probable que exista algún grado de inexactitud en los resultados obtenidos. Por tanto, estas muestras también deben enviarse refrigeradas y con alta prioridad. Algunos laboratorios aceptan muestras de orina con la adición de un conservante como el ácido bórico, pero los clínicos deben contactar con dichos laboratorios para obtener protocolos específicos. ( See also page Descripción general del aparato urinario.)

Las pruebas basadas en la detección de características genéticas específicas van desde el análisis del cariotipo hasta la identificación de genes específicos. Se debe contactar con el laboratorio que ofrece la prueba para determinar las especificidades de la recogida y manipulación de la muestra; las muestras requeridas varían desde pelo a piel o sangre. Muchos análisis de sangre requieren la recogida en tubos de ácido-citrato-dextrosa con tapón amarillo y el envío durante la noche de los tubos refrigerados al laboratorio. Las muestras de tejido para el análisis genético deben desmontarse y enviarse inmediatamente después de la recolección. Como ocurre con la mayoría de las técnicas moleculares, la recogida aséptica y la prevención de la contaminación cruzada entre las muestras es fundamental para obtener resultados fiables.

• La comunicación entre el clínico y el laboratorio de diagnóstico veterinario es fundamental para asegurarse de que se utilizan la prueba y la muestra adecuadas y de que los resultados se interpretan correctamente.

• Las muestras deben etiquetarse claramente con un marcador impermeable en los contenedores primarios apropiados, y luego enviarse al laboratorio usando el formato de "barrera de tres capas", incluido un formulario de presentación debidamente protegido que detalle las características del caso y las solicitudes de pruebas específicas.

• Asociación Internacional de Transporte Aéreo

• US Postal Service Postal Explorer