La transferencia de embriones en la industria equina se ha utilizado principalmente para obtener descendencia de yeguas con potencial reproductivo restringido (yeguas con subfertilidad no diagnosticada, enfermedades uterinas o simplemente yeguas mayores) o de yeguas de rendimiento deportivo que deben permanecer no gestantes para continuar compitiendo. La mayoría de las asociaciones de razas equinas permiten el registro de potros nacidos por transferencia de embriones, y un número creciente ahora permite el registro de potros múltiples nacidos en el mismo año. Debido a esta relativamente reciente y mayor aceptación en los registros de razas equinas, muchos criadores de caballos han obtenido de una sola yegua donante varios potros en una temporada de reproducción.
La superovulación de yeguas con un preparado de extracto de hormona foliculoestimulante equina purificada (eFSH) para aumentar las tasas de ovulación y recuperación embrionaria ya no se realiza de forma comercial. Las dificultades con la fabricación de gonadotropinas adecuadas y la respuesta variable de las yeguas a la estimulación de la FSH han impedido el uso comercial generalizado de este método para producir embriones equinos. Se pensaba que la baja tasa de recuperación embrionaria en yeguas que ovulaban >4 folículos/ovario podría atribuirse a una incapacidad de la fosa ovárica para acomodar múltiples ovulaciones en esa área, o alternativamente, una respuesta excesiva a la estimulación de la FSH podría dar lugar a una producción desmedida de ovocitos.
El embrión equino es muy difícil de criopreservar, probablemente debido a que su diámetro es relativamente grande y a la presencia de una cápsula embrionaria que limita la interacción entre los agentes crioprotectores y el embrión. Los embriones de mórula o blastocisto temprano (<6,5 días después de la ovulación) son los preferidos para la criopreservación, porque después de la descongelación, los embriones de estadios más avanzados tienen baja calidad morfológica, lo que da lugar a tasas de gestación precarias. Comercialmente hay disponible un medio de vitrificación para embriones de équidos del que se han descrito tasas de gestación aceptables que varían entre del 40 al 60 %. También se ha descrito la criopreservación exitosa de blastocistos equinos expandidos para embriones cuyos blastoceles colapsaron después de procedimientos de biopsia embrionaria (consulte el vídeo del procedimiento de colapso del embrión).
Dado que se suelen recuperar uno o dos embriones de yeguas donantes, las evaluaciones de la aptitud reproductiva deben hacerse tanto para las yeguas donantes como para las receptoras de embriones. La ecografía diaria del útero y los ovarios de las yeguas donantes y receptoras potenciales durante el celo proporciona información crucial sobre el momento de la ovulación, lo que es esencial para determinar el día de la ovulación y el día de la recolección del embrión y para ayudar a la selección de las receptoras candidatas cualificadas para la transferencia del embrión.
Actualmente se utilizan técnicas no quirúrgicas para recoger y transferir embriones de équidos. Los embriones se suelen recuperar el día 7 u 8 tras la ovulación de la yegua donante (día 0 = ovulación). El uso de buenas técnicas estándar suele producir una tasa de recuperación de ~75 %; esta tasa puede llegar a valores tan altos como del 90 % en las yeguas jóvenes o fértiles o tan bajos como el 10-20 % en las yeguas subfértiles. Antes de la recogida del embrión, se realiza la palpación rectal y la ecografía principalmente para valorar la presencia del cuerpo lúteo, el grado de tono cervical y la ausencia de cualquier líquido en el útero. Se puede utilizar un jabón suave o un exfoliante de povidona yodada para lavar la región perineal, seguido de un enjuague completo con agua limpia.
En la mayoría de los casos no se utiliza la sedación, pero puede ser necesaria cuando se trabaja con yeguas que no cooperan. Se debe evitar la acepromacina, ya que puede causar relajación del útero y potencialmente perjudicar la recuperación de líquidos o la manipulación del aparato reproductor durante el lavado del útero; es preferible la sedación con un agonista de los receptores alfa2-adrenergicos (p. ej., xilacina o detomidina).
La recogida de embriones se realiza mediante un procedimiento de lavado uterino transcervical rutinario, empleando un catéter de silicona con un manguito inflable. Usando una técnica estéril, el catéter de silicona (que mide de 71 a 86 cm de largo y de 28 a 37 F, según el tamaño del tracto reproductivo de la yegua) se introduce en el útero a través del cuello uterino, y después se infla el balón (por lo general 60-80 mL) con aire o medio de recolección; luego el catéter se retira suavemente para que el manguito selle el orificio cervical interno. El medio de lavado completo con antibióticos, surfactante y albúmina sérica bovina está disponible comercialmente y listo para su uso. Alternativamente, como en el caso del ganado vacuno, se pueden preparar medios de lavado con solución PBS de Dulbecco y SFB al 1-5 %; se infunden 1-2 L en el útero y después se dejan fluir hacia un cilindro graduado o un balde de plástico para medir el volumen recuperado.
Una vez que el útero está lleno, se puede manipular suavemente por vía rectal para ayudar a la recuperación de líquido. Un filtro de embriones equipado con una malla de 75 mcm se suele conectar al final del tubo de salida para producir ~40-60 mL de líquido. En algunos casos, se puede administrar una inyección de oxitocina (10 U, IM o SC) para minimizar la retención de una gran cantidad de medio de lavado en el útero. El líquido recuperado debe estar limpio y libre de una cantidad significativa de restos y sangre. Se debe recuperar casi el 100 % del líquido utilizado en el lavado uterino. Se usa un total de 4-8 L de medio de lavado para completar el procedimiento de recolección de embriones (lavado). Si se sospecha que existe retención de líquido o si se interrumpe el flujo de salida, se puede hacer una ecografía transrectal para evaluar la presencia de líquido intraluminal. Una causa frecuente de la interrupción del drenaje del medio de lavado se produce al colocar la punta del catéter intracervicalmente y no en el cuerpo del útero: el medio fluye fácilmente hacia el útero, pero no hacia fuera.
Una vez que se completa el lavado, el líquido restante en el filtro se examina en una placa estéril con rejilla con un aumento de ×15 utilizando un estereomicroscopio. Una vez que se encuentra el embrión, se transfiere a un pocillo en una placa de cultivo tisular estéril que contiene un medio de retención (comercial, listo para usar con albúmina al 0,4 % o preparado con solución PBS de Dulbecco más SFB al 10-20 %). El embrión debe lavarse al menos 3 veces transfiriéndolo a otros dos pocillos previamente rellenados con medio de retención. La manipulación del embrión se realiza con una pajuela de 0,25 mL conectada a una jeringa de tuberculina con una aguja de calibre 16, una pajuela de 0,5 mL conectada directamente a una jeringa de tuberculina o una pipeta capilar (20 mcL) unida a una jeringa de tuberculina. Después de lavarlo, el embrión se debe transferir a una yegua receptora (dentro de 1 h) o preparar para un breve almacenamiento y transporte. Se debe registrar el estadio del embrión (mórula, blastocisto inicial o expandido) y la calidad (1, excelente; 5, muerto).
Aunque se pensaba que la transferencia quirúrgica de embriones equinos producía tasas de gestación más altas que las técnicas de transferencia no quirúrgica, estas últimas son ahora el método preferido para transferir embriones en esta especie. Las yeguas receptoras deben estar saludables tener un buen estado reproductivo y una buena condición corporal. La sincronización de la ovulación debe maximizarse mediante la manipulación hormonal del ciclo estral y la ecografía transrectal diaria. Las tasas de gestación buenas se consiguen utilizando receptoras que han ovulado desde 1 día antes hasta 3 días después de las donantes. Además, los progestágenos como el altrenogest pueden usarse hasta el día de la exploración de la gestación, 4-5 días después de la transferencia (~12-13 días de gestación).
La transferencia de embriones no quirúrgica se realiza mediante cateterismo transcervical. Se usan pajuelas de plástico (de 0,25 o 0,5 mL), para cargar el embrión; la columna del medio que contiene el embrión debe estar rodeada por dos pequeñas columnas de aire, que a su vez están rodeadas por dos columnas del medio. La pajuela cargada con el embrión se coloca en una pistola de transferencia de embriones. Las vainas de transferencia de embriones con expulsión lateral pueden minimizar el daño embrionario durante el procedimiento de transferencia.
Cortesía del Dr. Carlos Pinto y del LSU Comparative IVF Laboratory.
En entornos comerciales se ha dado un avance en las tecnologías de transferencia de embriones debido a la posibilidad de producir embriones equinos in vitro aplicando una inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) utilizando ovocitos inmaduros recogidos mediante recogida de óvulos (OPU). El semen congelado de sementales muertos puede usarse eficazmente para producir embriones in vitro tomando solo una porción de una pajuela de semen congelada para utilizarla en la técnica ICSI. El número de potros nacidos después de la transferencia de embriones equinos OPU-ICSI ha aumentado sustancialmente durante los últimos 10 años.
Desarrollado en la década de 1990, el OPU-ICSI se ha utilizado cada vez más para producir embriones in vitro, ahora en uso rutinario por varios laboratorios en EE. UU., Europa y América del Sur. La aceptación de esta tecnología de reproducción asistida refleja el tiempo que la mayoría de los registros de razas tardaron en aceptar el uso de la inseminación artificial y la transferencia de embriones para producir potros.
Brevemente, los ovocitos inmaduros se recogen de yeguas donantes no estimuladas y se someten a maduración in vitro inmediatamente después de la extracción o después de ser mantenidos durante <24 horas en un medio de almacenamiento de embriones normal; retener los ovocitos antes de colocarlos en un medio de maduración in vitro ayuda a programar el procedimiento de inseminación in vitro (ICSI) en un momento conveniente para el personal del laboratorio, por lo general 24-28 horas después de ser incubados en un medio de maduración in vitro. La retención de ovocitos no parece ser perjudicial para la producción de embriones, según las tasas de escisión y producción de blastocitos.
Los embriones se cultivan durante al menos 7 días e invariablemente se transfieren solo en la fase de blastocisto. El uso de yeguas receptoras que están en el día 4-6 del diestro parece dar lugar a tasas óptimas de gestación. Aunque el éxito de la OPU-ICSI puede variar mucho, se produce un promedio de ~1 blastocisto de embrión transferible por sesión de OPU-ICSI, con un 60-70 % de yeguas receptoras que quedan gestantes después de la transferencia de un embrión. Más recientemente, el éxito en la gestación de la transferencia de embriones OPU-ICSI congelados-descongelados ha sido de ~50 %.
Preparación para la conservación breve y el transporte para la transferencia de embriones en caballos
Los criadores de équidos que no tengan un número adecuado de receptoras y los veterinarios con una inversión modesta en equipamiento pueden recoger los embriones y prepararlos para un almacenamiento breve y transporte a una instalación centralizada de transferencia de embriones.
Las tasas de gestación no parecen diferir de las obtenidas con embriones frescos, especialmente si los embriones se envían de un centro a otro en el mismo día en que se recogen. De forma rutinaria, los embriones se envían en medios de almacenamiento disponibles comercialmente que son preparaciones que contienen albúmina sérica bovina al 0,4 % y antibióticos y que están listas para usar. El embrión se coloca en un vial criotubo de polipropileno de 2 mL o en un tubo con tapón a presión de 5 mL que contiene el medio de sujeción. El tubo con el embrión se coloca en un contenedor de transporte de semen diseñado para enfriar y transportar el semen de caballo. El contenedor se envía preferiblemente a una instalación de transferencia de embriones el mismo día en que se realiza la recogida por vía aérea o se procesa para entregarlo durante la noche a través de un servicio de mensajería.
