Las células que se recuperan desde el estadio de embrión temprano hasta el estadio de mórula, funcionan eficazmente como células donantes para la clonación. La clonación a partir de células embrionarias se realizó con éxito durante más de una década antes del nacimiento del primer mamífero producido por transferencia nuclear usando células somáticas adultas ("Dolly", una oveja descrita por el Instituto Roslin, Escocia, en 1997). La clonación usando células somáticas diferenciadas como donantes nucleares se denomina transferencia nuclear de células somáticas o SCNT.
El tejido conectivo subcutáneo es el tejido más utilizado para la clonación de animales adultos. El tejido se pica y se cultiva in vitro. Los fibroblastos que han crecido se recogen y se vuelven a sembrar (pasar) en nuevas placas para continuar la proliferación hasta que se hayan producido millones de células. Estos se criopreservan de la forma usual para utilización en el futuro.
Para la transferencia nuclear se necesitan ovocitos maduros de la misma especie o de especies estrechamente relacionadas con ella (esencialmente subespecie). La composición mitocondrial de los ovocitos puede ser importante, aunque su valor genético no lo es porque el clon resultante tendrá mitocondrias del ovocito hospedador (véase abajo). Por lo general, los ovocitos se recuperan del material obtenido en el matadero y luego se maduran in vitro, aunque en algunas especies se recogen ovocitos maduros meióticamente (de los folículos preovulatorios o del oviducto después de la ovulación).
La transferencia nuclear se realiza usando un microscopio con micromanipuladores. Los cromosomas del ovocito se eliminan, creando un ovocito enucleado u ooplasto. La célula somática utilizada para la clonación debe estar sincronizada al principio del ciclo celular (antes de la síntesis de ADN). La célula somática se combina con el ooplasto, tanto por la fusión de la membrana utilizando un pulso eléctrico como por la inyección directa de la célula donante en el ooplasto mediante micromanipulación.
El ovocito recombinado, que ahora contiene el núcleo de la célula donante, se trata para imitar la señal de activación de la fertilización, lo que lo estimula a convertirse en un embrión. Después de la activación, el embrión en desarrollo puede transferirse quirúrgicamente al oviducto de una hembra receptora o, como en la transferencia estándar de embriones, puede cultivarse in vitro hasta un estadio en el que pueda transferirse al útero transcervicalmente (no quirúrgicamente),
Salud y fenotipo de los animales domésticos clonados
En la salud y el fenotipo del individuo clonado influyen varios factores como los efectos epigenéticos, el ADN mitocondrial, el entorno uterino y posnatal, las mutaciones y la variación individual.
Efectos epigenéticos
Después de la transferencia nuclear, el ooplasto debe reprogramar el ADN de la célula somática para que funcione igual que el de un cigoto. Esto se controla principalmente por la metilación y desmetilación de las bases de ADN y por la modificación de las histonas, las proteínas sobre las que se envuelve el ADN. El control de la transcripción del ADN realizado de esta forma, sin alterar la estructura del ADN, se denomina control epigenético. Inicialmente en el momento de la clonación, el ovocito debe reprogramar el ADN de la célula donante y luego ha de mantener los patrones normales de modificación epigenética a través de las diferentes etapas de desarrollo.
La cantidad y precisión de la reprogramación del ADN del donante es probablemente la razón principal del éxito o fracaso del desarrollo fetal en la clonación. Las deficiencias menores al conferir el estado epigenético normal pueden no afectar a la salud general del individuo clonado, pero pueden causar variaciones en su fenotipo con respecto al del animal donante. Un ejemplo visible de esto se apreció en CC, el primer gato clonado. CC expresa solo el color del pelaje marrón, mientras que su donante genético expresa tanto el anaranjado como el marrón (p. ej., el calicó). Dado que el cromosoma X es portador del gen del color del pelaje en los gatos, esto indica que en CC, la inactivación del cromosoma X no se produce de forma aleatoria; mejor dicho, el cromosoma X se inactiva en todas las células, presumiblemente debido a que, en el momento de la clonación, este cromosoma inactivo no se reactivó.
Uno de los principales tejidos afectados por el fallo de la reprogramación epigenética normal después de la SCNT es la placenta. Gran parte de la pérdida de gestaciones asociada con la transferencia de embriones derivados de SCNT se atribuye a una función placentaria anormal.
Los efectos epigenéticos también pueden influir en el fenotipo del animal derivado de la transferencia nuclear después del nacimiento; por ejemplo, un animal con genes de factores de crecimiento transcritos a niveles elevados puede crecer más que su hermano clonado con genes menos activos, aunque el número real y la composición de los genes sean los mismos. Sin embargo, se ha demostrado en todas las especies estudiadas que las principales anomalías epigenéticas presentes en los animales clonados no se transmiten a la descendencia de los clones, porque el estado epigenético de las células se restablece durante el desarrollo de los espermatozoides y los ovocitos.
ADN mitocondrial
El embrión de transferencia nuclear tendrá el ADN nuclear del donante genético, pero tendrá el ADN mitocondrial del ooplasto empleado. También puede haber un bajo número de mitocondrias de la célula donante, pero suelen ser pocas proporcionalmente. Actualmente no está claro el impacto que provoca el origen de las mitocondrias, o una mezcla de mitocondrias, en los rasgos de la progenie. Dado que las mitocondrias son la fuente de energía para la célula, las diferencias en las mitocondrias podrían tener un efecto potencial sobre la producción, la resistencia u otros rasgos físicos o de comportamiento. Además, la falta de comunicación entre el ADN nuclear transferido y las mitocondrias puede afectar al desarrollo de la placenta.
Las mitocondrias heterogéneas que tiene una hembra engendrada por transferencia nuclear se transmitirán a su descendencia porque están presentes en sus ovocitos. La descendencia puede heredar una proporción diferente de mitocondrias de ooplasto del donante y del hospedador que la que está presente en la hembra clonada debido al cuello de botella en el número de mitocondrias presentes en algunas etapas del desarrollo de los ovocitos. Para los clones masculinos, aunque el esperma de un macho producido por transferencia nuclear será portador de las mitocondrias heterogéneas, estas mitocondrias serán eliminadas después de que el esperma fertilice un ovocito, por lo que las mitocondrias del clon masculino no se encuentran en la descendencia. Por eso, se puede considerar que un clon macho produce una progenie que es genéticamente idéntica a la que el animal donante original hubiera producido.
Ambiente
El tamaño y la salud del útero; la producción de leche de la madre; los programas de nutrición, ejercicio y entrenamiento; y el manejo al que está expuesto el neonato pueden influir en el animal cuando sea adulto. Todos estos factores afectan también a la descendencia producida convencionalmente, pero sus efectos son visibles en los clones porque existe un fenotipo esperado (el del animal donante). Por ejemplo, CC, la gata clonada, es extrovertida y sociable, mientras que su donante genético era reservado. Sin embargo, el donante genético era un gato de investigación, criado en una jaula y no acostumbrado a la atención, mientras que CC se crio con una sobreabundancia de atención y estimulación.
Mutaciones
Las mutaciones genéticas son más probables en animales clonados, porque las células cultivadas se usan como fuente de ADN. Las células del donante crecen y se someten a pases in vitro y esto, a medida que aumentan los pases, se asocia con un número creciente de anomalías cromosómicas. Sin embargo, es poco probable que las células con anomalías cromosómicas produzcan embriones viables.
Variación individual
La diferenciación celular se produce en cascada, ya que la diferenciación de un tipo celular afecta al estado de las células que lo rodean. Durante el desarrollo, la multiplicación celular y la apoptosis se producen como respuesta a muchos estímulos ambientales e internos. Por lo tanto, se producirán variaciones individuales aleatorias en la composición de los tejidos, incluso en individuos del mismo origen genético. Un ejemplo visual de esto son las marcas de los animales clonados; los individuos clonados a partir de la misma línea celular tienden a presentar manchas blancas en lugares similares, pero las manchas pueden variar totalmente en tamaño y forma.
