La microbiología realizada en la clínica puede ser una herramienta valiosa, ya que proporciona a los veterinarios resultados rápidos, con una inversión mínima. Para la recuperación de patógenos bacterianos aerobios o anaerobios facultativos comunes como Staphylococcus spp, Streptococcus spp y coliformes, no se suelen necesitar equipos y materiales costosos. Aunque el medio microbiológico no es difícil de preparar, puede ser más conveniente comprarlo a un distribuidor de materiales científicos. La mayoría de las bacterias crecerán fácilmente en medios estándar (placas de agar sangre y agar MacConkey) cuando se incuban en ambiente aerobio. El equipo básico debe incluir una incubadora, un refrigerador, un mechero Bunsen o un soplete de gas portátil y un microscopio con diferentes objetivos a bajo o alto aumento, y aceite de inmersión. Los materiales deben consistir en asas de inoculación, medios microbiológicos preparados, portaobjetos, reactivos de tinción de Gram, peróxido de hidrógeno al 3 %, reactivo de oxidasa, sistemas de identificación microbiana y un libro de texto actualizado de microbiología veterinaria.
Selección y obtención de la muestra:
Aunque no siempre es fácil obtener muestras óptimas cuando se trabaja con animales, ciertas prácticas pueden garantizar la colección de la mejor muestra dependiendo de la circunstancia. La aplicación de los siguientes principios debe dar como resultado muestras aceptables que produzcan resultados microbiológicos de alta calidad. 1) Las muestras deben obtenerse asépticamente de un lugar que sea representativo del proceso de la enfermedad. 2) Los hisopados son las muestras recogidas más comúnmente, pero por lo general no son las muestras de elección, ya que pueden contaminarse con comensales durante el proceso de obtención y proporcionan un volumen pequeño de muestra. Los hisopos son muy útiles para obtener muestras de pústulas de la piel, orejas, conjuntiva, fistulas profundas o heridas e infecciones de tejido blando o del tracto reproductivo. 3) Para permitir un examen adecuado, ha de recolectarse una cantidad suficiente de material. 4) Las muestras se deben recoger en el momento apropiado del proceso patológico y antes del inicio del tratamiento antimicrobiano, para maximizar la recuperación del patógeno. 5) Si los cultivos no se inician de inmediato tras la recogida, las muestras se deben refrigerar.
Procesamiento de la muestra:
Las pruebas microbiológicas deben incluir tanto el examen microscópico directo como el cultivo de la muestra. Los frotis teñidos con Gram deben examinarse mediante aceite de inmersión para determinar la reacción correcta. Por lo general, deben inocularse a medios sólidos (agar) y líquidos (caldo de cultivo). Los medios sólidos permiten el aislamiento de colonias, la cuantificación aproximada de bacterias y la selección o diferenciación de la flora normal de los potenciales patógenos, mientras que los medios líquidos permiten la recuperación de pequeñas cantidades de organismos.
Las muestras clínicas deben inocularse tanto en medios de uso general como selectivos para maximizar la recuperación bacteriana. Las placas que contienen tripticasa/agar de soja tríptica con un 5 % de sangre de oveja son los tipos de medios más utilizados en la práctica. Los medios selectivos y/o diferenciales incluyen agar MacConkey (bacterias gramnegativas), agar manitol salado (estafilococos) y agar con alcohol feniletílico (bacterias grampositivas). Los medios microbiológicos deben almacenarse en el refrigerador, dejándolos a temperatura ambiente antes de la inoculación.
La transferencia de muestras a medios en placa depende del tipo de muestra. Las muestras líquidas se inoculan con una jeringa estéril o con una pipeta. Los hisopos se aplican extendiéndolos directamente sobre un área de ~2 cm de diámetro. Las heces se inoculan embebiendo un hisopo dentro de la muestra. Las muestras de biopsia quirúrgica pueden tocar directamente la superficie del agar.
Los métodos de identificación bacteriana dependen de la obtención de colonias aisladas. La técnica más común para lograr el aislamiento es realizar extensiones en la placa con un lazo de alambre. Una vez que la muestra se ha inoculado en la placa, se flamea un asa, se enfría y se pasa varias veces a lo largo del área de inoculación con un ángulo de 90°. La placa se gira 90°, el asa se quema y se enfría, y el proceso se repite tres veces más. En la placa quedan cuatro cuadrantes que permiten la cuantificación del número relativo de bacterias presentes en una muestra determinada después de que aparezcan las colonias.
Después de la inoculación, las placas y los tubos deben etiquetarse y colocarse en una incubadora a 35-37 °C. Las placas se incuban con las tapas hacia abajo para evitar que el agua condensada caiga de la tapa a la superficie del agar, lo que puede dar lugar a un crecimiento bacteriano confluyente.
Identificación bacteriana:
El primer paso para la evaluación del cultivo es el examen visual de la placa cultivada. La mayoría de las bacterias producen colonias visibles en 24 h, aunque algunas requieren 48-72 h. La inspección comprende el examen de la morfología de la colonia, el tipo y la cantidad de colonias y cualquier reacción hemolítica en el agar sangre. La clasificación adicional se basa en la presencia o ausencia de crecimiento en medios diferenciales o selectivos.
Después de la evaluación de la placa cultivada, se realiza la tinción de Gram para el examen de cada tipo de colonia. Esas reacciones, combinadas con la morfología colonial, pueden permitir la presunta identificación de organismos. Si hay más de un tipo de colonia, se realizan subcultivos de cada uno. Una sola colonia se cultiva en una placa de medio no selectivo. Esto asegurará el cultivo puro del organismo desconocido, necesario para la caracterización e identificación bioquímica.
Hay varios sistemas de identificación microbiana disponibles comercialmente. Los sistemas pueden ser manuales o automatizados. Cada uno suele contener un paquete completo para la identificación de un grupo particular de organismos. Hay sistemas específicos para estafilococos, estreptococos, corinebacterias, bacilos gramnegativos no fermentativos y enterobacterias. Todos son útiles para realizar una amplia variedad de pruebas bioquímicas simultáneamente. La mayoría de los sistemas manuales constan de placas o tiras formadas por una serie de pocillos o copas que contienen sustratos de prueba. A los pocillos de prueba se añade un cultivo puro del organismo desconocido en suspensión. Las tiras se incuban aeróbicamente a 37 °C durante 24-48 h. Se observan los pocillos para visualizar los cambios colorimétricos, y se genera un código biológico a partir de la puntuación de los resultados de la prueba. Este código numérico se compara con los de la base de datos del sistema para obtener la identidad del organismo. La mayoría de los sistemas son adecuados para la identificación de patógenos veterinarios comunes de crecimiento rápido de aerobios a facultativamente anaerobios.
Antibiograma:
El antibiograma está indicado cuando la sensibilidad de un patógeno no se puede predecir de manera fiable a partir de la experiencia del técnico o la identidad del patógeno, o si el agente antimicrobiano de elección para uso terapéutico no es aceptable. Hay dos procedimientos comunes para determinar la sensibilidad a los antimicrobianos de las bacterias que pueden crecer aeróbicamente en 24 h. Ambos están aceptados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). El primer procedimiento es cualitativo y se basa en el método de difusión en disco de agar de Bauer y Kirby. El segundo procedimiento es cuantitativo e implica diluciones de agentes antimicrobianos probados en medio líquido o sólido. Este último se denomina prueba de concentración mínima inhibitoria.
El método de difusión en disco de agar se usa más ampliamente para testar las bacterias patógenas comunes, aerobias de rápido crecimiento y anaerobias facultativas, y se presta mejor a las pruebas internas. El método Bauer-Kirby se basa en la difusión de un agente antimicrobiano impregnado dentro de un disco de papel a través de un medio de agar. Una suspensión del organismo en crecimiento activo se estandariza rápidamente a una turbidez equivalente a 0,5 en la escala de McFarland. Dentro de los 15 min posteriores a la estandarización, se sumerge un hisopo estéril en la suspensión bacteriana y se inocula una placa seca de agar Mueller-Hinton pasando el hisopo tres veces sobre toda la superficie. Para asegurar una distribución uniforme del inóculo, la placa se gira ~60° cada vez. Se colocan discos antimicrobianos en la placa y se presionan suavemente para asegurar su contacto cercano con la superficie del agar. Las placas invertidas se colocan en una incubadora a 35 °C. Las placas se examinan después de 18 h de incubación. Las zonas de inhibición completa se miden en milímetros. Los tamaños de las zonas alrededor de cada fármaco se comparan con los publicados por el CLSI en el documento VET01-S2: Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals para hacer una interpretación de sensible, intermedia o resistente para cada agente testado.
Los resultados reales de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos solo pueden obtenerse siguiendo los procedimientos estandarizados establecidos en el documento CLSI VET01-A4: Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals, Second Informational Supplement. Cualquier desviación del procedimiento puede dar lugar a resultados erróneos. Es necesario almacenar adecuadamente los discos de sensibilidad a los antimicrobianos y los medios de análisis y garantizar el control de calidad de cada prueba. Cualquier clínica que no realice pruebas con regularidad semanalmente puede necesitar un laboratorio de diagnóstico veterinario para este procedimiento.
