Dado que las hormonas circulan en pequeñas cantidades por la sangre, la medida exacta de estas sustancias requiere efectuar ensayos sensibles, por lo general en forma de inmunoensayo competitivo. El método original es el radioinmunoensayo, que emplea un anticuerpo dirigido contra la hormona y una forma de radiomarcador de la hormona. La hormona marcada compite con la hormona sin marcar por los sitios de unión de los anticuerpos. Una curva estándar que contiene las cantidades conocidas de hormona se usa por comparación para calcular la concentración de la hormona en las muestras del paciente. El uso de marcadores radiactivos permite la detección de concentraciones bajas de hormona, que típicamente circulan en el rango picomolar (10–12) o nanomolar (10–9). En los últimos años, los marcadores no radioactivos (p. ej., quimioluminiscencia), los ensayos tipo "sándwich" y los métodos de ELISA se han desarrollado para la medición hormonal y su uso cada vez es más frecuente. Los instrumentos en el punto de atención o en la clínica diseñados para la medición hormonal también son de uso común en las prácticas veterinarias.
La medición con la máxima precisión en las especies veterinarias presenta algunos desafíos únicos, porque las concentraciones normales de una hormona específica pueden variar apreciablemente entre distintas especies. Por ejemplo, las concentraciones totales normales de T4 en perros y gatos son ~4 veces inferiores a las de las personas. La preocupación por la reactividad cruzada es importante; las hormonas proteicas/polipeptídicas varían en su composición de aminoácidos y en otras formas estructurales (p. ej., los patrones de glicosilación) a través de las distintas especies. Como consecuencia, los anticuerpos desarrollados contra una hormona en particular no pueden reconocer el material de otra especie. Finalmente, aunque las hormonas esteroideas son estructuralmente idénticas a través de las distintas especies (el cortisol en perros es idéntico al de las personas), las sustancias presentes en el suero de una especie dada pueden en ocasiones interferir en un ensayo, lo que conduce a resultados inexactos. En general, es importante que un laboratorio que proporciona la medición de una hormona en particular en una especie demuestre que el ensayo es válido para esa especie y que el laboratorio ha establecido los rangos normales.
