Dado el alto valor económico de algunos sementales y la voluntad de criar caballos basándose más en su potencial competitivo que en su aptitud reproductora, a veces se utilizan muchos recursos y pruebas muy caras con el fin de evaluar la aptitud reproductiva, y especialmente para evaluar la función espermática en aquellos sementales que se ha demostrado que son subfértiles después de su primera época de reproducción o porque muestran defectos potenciales después de un EAR rutinario. Tradicionalmente, un EAR completo ha incluido historia clínica, examen físico, examen de genitales externos e internos, cultivos de muestras uretrales y del pene y recogida y evaluación de al menos dos eyaculados recogidos en 1 h para evaluar el número total de espermatozoides, su motilidad y su morfología.
La historia clínica debe incluir la fertilidad previa del semental y el tipo de manejo reproductivo. Si se cubrieron <10 yeguas, debe considerarse la fertilidad individual de cada yegua si las tasas de gestación son bajas. Si recientemente el caballo ha estado compitiendo o entrenando, ha podido estar recibiendo esteroides anabolizantes u otros fármacos. Los sementales que se hayan retirado recientemente de participar en carreras se pueden volver evaluar en 3-6 meses si no superan el primer EAR.
Durante la exploración física del semental, se debe evaluar su condición corporal y la presencia de alguna enfermedad que pudiera afectar a la reproducción. Los defectos hereditarios, incluyendo la boca de loro y las cataratas, hacen que el semental sea inadecuado para la reproducción. La ceguera, cojera o ataxia, parálisis del pene u otros defectos que impiden que el semental sea apto para la reproducción también lo clasifican como insatisfactorio en cuanto a las perspectivas reproductoras. La evidencia científica reciente apoya que la criptorquidia es un defecto potencialmente hereditario en los caballos, por lo tanto esto convierte al semental en un animal no apto para la reproducción.
La palpación escrotal debe hacerse después de la primera eyaculación cuando el semental esté más relajado. La anchura escrotal total debe medir >8 cm (preferiblemente >9 cm), medido con un calibrador romo en ambos testículos juntos. Los testículos deben ser firmes, elásticos y homogéneos a la palpación. Los epidídimos discurren dorsalmente a lo largo de los testículos, en una orientación craneocaudal, con la cola en posición caudal. La cola del epidídimo es fácilmente palpable, mientras que el cuerpo y la cabeza del epidídimo tienden a juntarse con la superficie dorsal del testículo. La rotación del testículo 180° (la cola del epidídimo se palpa en la cara craneal de los testículos), también llamada torsión del cordón espermático, es frecuente y no tiene importancia clínica en sementales sanos.
También se suele usar la ecografía para evaluar el contenido escrotal y para tomar medidas individuales de cada testículo. Se puede utilizar un ecógrafo portátil equipado con un transductor lineal de 5 MHz que se suele utilizar para la evaluación reproductiva de yeguas. Los testículos deben tener un aspecto ecogénico homogéneo; una sección transversal o longitudinal de una vena central que se encuentra a lo largo de la zona longitudinal del testículo comenzando en el polo craneal es un sello distintivo del testículo equino normal y no debe confundirse con una patología. La cola del epidídimo y el cordón espermático muestran un aspecto homogéneo "como una gasa"; las dilataciones asimétricas de los vasos del cordón espermático pueden ser compatibles con las venas varicosas y pueden o no afectar el flujo sanguíneo y la función testicular. Las medidas del ancho (W), la altura (H) y la longitud (L) de cada testículo se pueden usar para calcular el volumen testicular y estimar la producción diaria esperada de espermatozoides aplicando las siguientes fórmulas: volumen testicular = (W × H × L) × 0,5233 para cada testículo; producción diaria de espermatozoides = (0,024 × volumen testicular) − 0,76, donde el volumen testicular es el volumen total, o la suma del volumen de ambos testículos.
El pene se suele examinar mientras se lava antes de la primera recogida de semen. El pene puede variar en tamaño sin ningún efecto sobre la fertilidad. Debe ser libremente distensible desde el prepucio, sin lesiones. De todos los genitales internos del semental, las ampollas, las vesículas seminales y los lóbulos de la próstata son palpables mediante un tacto rectal. Las vesículas seminales son difíciles de palpar a menos que al semental se le estimule con una yegua en celo para favorecer el llenado de la glándula con líquido. Las glándulas bulbouretrales están cubiertas de músculo, haciendo imposible palpar su estructura. La ecografía transrectal se puede utilizar para evaluar más a fondo cada una de las glándulas sexuales accesorias y la uretra pélvica. Debido al peligro inherente a la inmovilización adecuada de un semental, solo si se considera necesario por un hallazgo anormal en el resto de la exploración como sangre o pus en el eyaculado, algunos veterinarios llevan a cabo un examen transrectal. Cuando se realiza una palpación por recto en un semental, los anillos inguinales internos deben también palparse para determinar su tamaño y la presencia de cualquier anomalía. Se palpan como pliegues de peritoneo que forman bolsillos en la pared abdominal interna, localizados, según las agujas del reloj, en la posición de las 3 y las 9, a la entrada de la pelvis.
El semen se recoge del semental usando una VA llena de agua a ~50 °C, que suele enfriarse a 42-45 °C en el momento de la colección; algunos sementales pueden estar acostumbrados a temperaturas de VA más altas (50-55 °C) para una estimulación adecuada, pero la temperatura interna de la VA no debe exceder los 55 °C en el momento de la recogida del semen. El semental se engaña con una yegua en celo (u ovariectomizada); una vez lograda la erección, el pene se lava con agua tibia y se seca con una toalla de papel. Si se sospecha que la piel del pene alberga bacterias potencialmente transmisibles (p. ej., Klebsiella Pneumoniae o Pseudomonas aeruginosa), debe hacerse un cultivo de una muestra de la vaina y de la fosa del glande antes de que el área peniana se lave y aclare para la recogida del semen. Algo de esmegma puede rellenar el divertículo uretral dorsal, localizado dorsal al proceso uretral, y endurecerse para formar una "judía". Esto puede causar irritación e hinchazón y, por lo tanto, debe evitarse. Después de lavar y secar el pene, se obtiene una muestra de la uretra distal. A continuación, se permite al semental que monte a la yegua o al maniquí (maniquí de monta) y el semen se recoge dirigiendo el pene hacia la VA. Se toma una segunda muestra de la uretra distal inmediatamente después de la eyaculación. Al semental se le debe dar 1 h de descanso antes de recoger el segundo eyaculado.
Los resultados de los cultivos de las muestras uretrales pueden ser difíciles de interpretar. Los cultivos del prelavado del pene suelen mostrar un crecimiento mixto de bacterias de moderado a alto. Los hisopos de preeyaculado uretral también pueden mostrar un crecimiento de una población mixta de bacterias. El crecimiento de Pseudomonas o Klebsiella puede indicar que el pene está contaminado por estos organismos; en EE. UU., estas son las únicas bacterias (junto con Taylorella equigenitalis, que provocan la metritis contagiosa equina, [XRef]) que, en algunos casos, pueden pasar a las yeguas y causar endometritis. El frotis uretral poseyaculado debe mostrar menor crecimiento bacteriano porque la uretra se ha "lavado" con el eyaculado. El alto número de bacterias, en especial de una única especie, en el cultivo poseyaculado puede indicar una infección de los órganos genitales internos, frecuentemente la uretra y/o vesículas seminales.
El eyaculado se debe evaluar en cuanto a su apariencia, volumen, concentración de espermatozoides, motilidad espermática, porcentaje de espermatozoides con morfología normal y porcentajes de anomalías morfológicas específicas de los espermatozoides. El eyaculado debe carecer de pus, orina o sangre. El eyaculado normal puede contener gel, un material viscoso, de transparente a turbio, que se origina en las vesículas seminales y forma la tercera y última fracción del eyaculado. Debido a que se expulsa en último lugar, la fracción de gel se puede eliminar colocando un filtro en la boca de la botella de recolección o mejor en la VA, o alternativamente, vertiendo el eyaculado a través de un filtro de leche una vez que se llegue al laboratorio.
El análisis del semen se hace en la fracción libre de gel (rico en esperma). La concentración puede determinarse usando un hemocitómetro o un instrumento fotométrico correctamente calibrado. Varios instrumentos especialmente diseñados para este propósito están disponibles comercialmente. Las evaluaciones de motilidad y morfología se realizan igual que lo descrito para el toro ( ver Examen de aptitud reproductiva de toros); no obstante, la concentración de espermatozoides es mucho menor en sementales (por lo general 100-400 millones/mL), por lo que solo se evalúa la motilidad espermática individual. La valoración de la motilidad debe realizarse tanto con semen fresco como con un semen diluido con un buen diluyente. El semen debe calentarse a 35-37 °C antes de valorar la motilidad de los espermatozoides.
En particular, las medidas convencionales de la calidad del esperma se correlacionan solo moderadamente con la fertilidad, y las variaciones en los porcentajes de espermatozoides móviles/progresivamente móviles y morfológicamente normales representan solo el 20 % de la variación total en la fertilidad. Dadas las limitaciones de las pruebas estándar de esperma para predecir la fertilidad o identificar a los sementales subfértiles, se han evaluado otras pruebas de esperma que pueden aplicarse para el EAR del semental realizado en centros de referencia. Aunque no proporciona necesariamente una mejor correlación con la fertilidad, el CASA ofrece una evaluación más objetiva y completa de las características del movimiento del esperma. Como en los toros, ciertos cambios en los diferentes parámetros de movimiento, a saber, el aumento de la velocidad curvilínea y la disminución de la linealidad y la rectitud, se correlacionan con la adquisición de una motilidad hiperactivada, que se ha caracterizado recientemente en los sementales. Además, la evaluación de la morfometría (forma) de la cabeza del esperma asistida por ordenador se ha sugerido como una prueba complementaria útil para predecir la fertilidad del semental. La integridad de la membrana puede evaluarse fácilmente mediante tinción con eosina-nigrosina (como en los toros), y la prueba de tumefacción hipoosmótica o la capacidad de los espermatozoides para hincharse para establecer un equilibrio osmótico con un medio circundante hipoosmótico también puede tener algún valor para la evaluación de la membrana espermática; sin embargo, no se ha establecido una correlación directa con la fertilidad. Las sondas fluorescentes como la rodamina 123 o JC-1 junto con la citometría de flujo también se han utilizado para evaluar el potencial mitocondrial y, por tanto, la integridad. Además, la combinación de estas con otras tinciones fluorescentes ofrece la ventaja de evaluar simultáneamente la viabilidad y la integridad de la cromatina en un gran número de espermatozoides. A este respecto, el ensayo de cromatina de la estructura del esperma, que evalúa la estabilidad de la cromatina del esperma, se ha investigado a fondo en sementales y se ha correlacionado moderadamente con la fertilidad. Es una buena prueba complementaria para sementales en los que los resultados de las pruebas rutinarias de laboratorio no se correlacionan con la subfertilidad o la infertilidad. Finalmente, las verdaderas pruebas de la función del esperma (es decir, la capacidad de fertilizar un ovocito) se han restringido debido a la incapacidad para capacitar el esperma del semental in vitro o para realizar la fertilización in vitro en esta especie. Los recientes avances en esta área pueden permitir la aplicación de estos ensayos para una evaluación más significativa de los espermatozoides de los sementales.
Además de evaluar la calidad del esperma, una vez que se han recogido dos eyaculados, el número total de espermatozoides en cada uno se calcula como volumen (libre de gel) × concentración.
El número total de espermatozoides en el segundo eyaculado de dos recolectados con 1 h de diferencia se considera una estimación aproximada de la producción diaria de espermatozoides para ese semental (es decir, los eyaculados se consideran representativos si el segundo eyaculado contiene alrededor de la mitad de espermatozoides del primero). El segundo eyaculado debe presentar el mismo porcentaje o un porcentaje ligeramente superior de espermatozoides morfológicamente normales, así como la misma motilidad que el primero. Si el número de espermatozoides o su calidad difiere de estas pautas, entonces o se ha producido un almacenaje prolongado de los espermatozoides en los conductos eferentes (véase más adelante) o uno de los eyaculados no fue completo y debe obtenerse un tercer eyaculado. El tercero debe contener alrededor de la mitad de los espermatozoides del segundo eyaculado y la misma o mejor morfología y motilidad. Puede también recogerse un tercer eyaculado si la evaluación seminal no parece coincidir con la anchura escrotal total (p. ej., un alto número de espermatozoides en un semental con testículos pequeños) o la producción de esperma diaria calculada. El almacenaje prolongado de espermatozoides en los conductos eferentes da como resultado un número alto en el primer eyaculado, pero estos espermatozoides pueden tener bajas motilidades y morfología.
Algunos sementales con un almacenamiento de espermatozoides extremo requieren una recogida diaria durante 7-10 días antes de obtener un eyaculado representativo (la evaluación del esperma es consistente en las sucesivas recogidas). En casos extremos, el esperma puede acumularse en las ampollas y densificarse, causando la obstrucción de los conductos deferentes. Esto puede dar lugar a que en el eyaculado no haya espermatozoides o pocos, por lo general con cabezas desprendidas. Pueden ser necesarios múltiples intentos de recogida antes de que desaparezca la obstrucción. El alivio del bloqueo suele ser evidente por la eyaculación de un gran número de espermatozoides muertos con cabezas desprendidas.
En los casos de obstrucción ampular grave o en sementales con problemas de eyaculación, los intentos de recogida de semen inicialmente pueden producir solo líquido seminal claro. En tales casos, podría estar justificado diferenciar entre estos problemas y la azoospermia (es decir, la falta de producción de esperma) antes de los intentos sucesivos de recogida de semen. Para este propósito, el líquido seminal recogido puede enviarse para la determinación de los niveles de fosfatasa alcalina. Dado que las concentraciones de fosfatasa alcalina son elevadas en el líquido epididimal, un valor <100 U/L es compatible con bloqueo o insuficiencia de la eyaculación, mientras que un valor >1000 U/L es compatible con la acumulación de líquido epididimal y, por lo tanto, con una verdadera azoospermia.
En un semental con un potencial reproductivo satisfactorio, el número de espermatozoides tras >5 días de descanso sexual debe ser de ≥8-10 mil millones en el primer eyaculado y de ≥4 mil millones en el segundo eyaculado. La motilidad total de los espermatozoides debe ser del ≥65 % y la motilidad progresiva del ≥50 %. Al menos un 50 % de los espermatozoides deben ser morfológicamente normales. Un semental se considera satisfactorio si produce al menos mil millones de espermatozoides progresivamente móviles y morfológicamente normales en el segundo (o tercer) eyaculado de dos (o tres) recogidos con 1 h de intervalo.
Los sementales se clasifican como reproductores potenciales "satisfactorios", "cuestionables" o "insatisfactorios" basándose en los resultados del examen detallado anterior. Sin embargo, la clasificación puede ser un tanto subjetiva, y un resultado excelente en una categoría puede equilibrar otro marginal de otra categoría. Los reproductores potencialmente satisfactorios deben alcanzar una tasa de concepción estacional de >80 % fecundando a 50 hembras por fecundación natural o a 120 por inseminación artificial bajo condiciones normales de manejo. Los reproductores potencialmente cuestionables pueden experimentar dificultades para lograr lo anterior. Por lo general, los sementales se clasifican en esta categoría si se detecta un problema que podría resolverse con el tiempo con o sin tratamiento; por lo tanto, se recomienda una nueva revisión dentro de los 6-12 meses. Los reproductores insatisfactorios tienen problemas que pueden hacer disminuir de forma acusada su fertilidad o tienen rasgos heredables no deseables que pueden transmitirse a la progenie. Algunos sementales se pueden usar para inseminar un porcentaje de yeguas con semen refrigerado transportado. En estas circunstancias, la longevidad de la motilidad de los espermatozoides debe comprobarse utilizando recipientes de semen comercial antes de llegar a una decisión acerca de la fertilidad potencial.
