Dado el alto valor económico de algunos sementales y la voluntad de criar caballos basándose más en su potencial competitivo que en su aptitud reproductora, a veces se utilizan muchos recursos y pruebas muy caras con el fin de evaluar la aptitud reproductiva, y especialmente para evaluar la función espermática en aquellos sementales que se ha demostrado que son subfértiles después de su primera época de reproducción o porque muestran defectos potenciales después de un EAR rutinario. Además, la extensión de un EAR también puede estar determinada por el uso previsto del semental en relación con factores como el tamaño esperado del libro genealógico de la yegua, o si el semental será utilizado para la monta natural o en un programa de inseminación artificial. Pueden ser necesarias pruebas adicionales si el semen del semental se va a transportar en frío o congelado-descongelado.
Tradicionalmente, un EAR completo ha incluido historia clínica, exploración física, exploración de genitales externos e internos, cultivos de hisopos de muestras uretrales y del pene, evaluación de la libido y la capacidad de monta, y recogida y evaluación de al menos dos eyaculados recogidos a lo largo de 1 hora.
Independientemente de las circunstancias de un semental en particular, el primer paso siempre debe ser obtener una anamnesis precisa que incluya los resultados de reproducción previos o el EAR, el uso previo, la nutrición, el estado de vacunación y los antecedentes de enfermedades. Los sementales de carreras o aquellos en entrenamiento pueden haber estado recibiendo esteroides anabólicos u otros fármacos. Por tanto, los sementales que se hayan retirado recientemente de participar en carreras se pueden volver evaluar en 3-6 meses si no superan el primer EAR.
Durante la exploración física del semental, se debe evaluar su condición corporal y la presencia de alguna enfermedad que pudiera afectar a la reproducción (p. ej., cojera o problemas en el dorso). Los defectos hereditarios, incluyendo la boca de loro y las cataratas, hacen que el semental sea inadecuado para la reproducción. La ceguera, cojera o ataxia, parálisis del pene u otros defectos que impiden que el semental sea apto para la reproducción también lo clasifican como insatisfactorio en cuanto a las perspectivas reproductoras. La evidencia científica reciente apoya que la criptorquidia es un defecto potencialmente hereditario en los caballos, por lo tanto esto convierte al semental en un animal no apto para la reproducción. Se pueden realizar pruebas de laboratorio comunes, como la prueba de Coggins, el hemograma completo, la bioquímica sérica y el análisis de orina, para comprobar la salud general de un semental.
La palpación escrotal debe hacerse después de la primera eyaculación cuando el semental esté más relajado. El escroto debe ser fino y elástico con un cuello bien definido. El escroto suele ser colgante; sin embargo, puede acercarse voluntariamente hacia el cuerpo durante la exploración. Los testículos con sus respectivos epidídimos deben moverse libremente dentro del escroto. Los testículos deben ser firmes, elásticos y homogéneos a la palpación. Los epidídimos discurren dorsalmente a lo largo de los testículos, en una orientación craneocaudal, con la cola en posición caudal. La cola del epidídimo es fácilmente palpable, mientras que el cuerpo y la cabeza del epidídimo tienden a juntarse con la superficie dorsal del testículo. El ligamento caudal del epidídimo es palpable como un nódulo pequeño (1-2 cm) adyacente a la cola del epidídimo y sirve como punto de referencia para determinar la orientación testicular dentro del escroto. La rotación del testículo 180° (la cola del epidídimo se palpa en la cara craneal de los testículos), también llamada torsión del cordón espermático, es frecuente y no tiene importancia clínica en sementales sanos.
También se suele usar la ecografía para evaluar el contenido escrotal y para tomar medidas individuales de cada testículo. Se puede utilizar un ecógrafo portátil equipado con un transductor lineal de 5 MHz que se suele utilizar para la evaluación reproductiva de yeguas. Los testículos deben tener un aspecto ecogénico homogéneo; una sección transversal o longitudinal de una vena central que se encuentra a lo largo de la zona longitudinal del testículo comenzando en el polo craneal es un sello distintivo del testículo equino normal y no debe confundirse con una patología. La cola del epidídimo y el cordón espermático muestran un aspecto homogéneo "como una gasa"; las dilataciones asimétricas de los vasos del cordón espermático pueden ser compatibles con las venas varicosas y pueden o no afectar el flujo sanguíneo y la función testicular.
El tamaño testicular está altamente correlacionado con la producción diaria de espermatozoides (PDE). El ancho escrotal total se ha usado por lo general para evaluar el tamaño testicular usando un calibre romo a través de ambos testículos juntos hasta el fondo del escroto. Este debe medir >8 cm (preferiblemente >9 cm) para que un semental se considere satisfactorio. Hoy en día, las mediciones de testículos individuales obtenidas mediante ecografía se consideran más precisas como forma de estimar la PDE esperada. El ancho (W), la altura (H) y la longitud (L) de cada testículo se pueden usar para calcular el volumen testicular aplicando las siguientes fórmulas: volumen testicular = (W × H × L) × 0,5233 para cada testículo, y el volumen testicular total (VTT) es la suma del volumen de ambos testículos. Entonces, la PDE se puede estimar usando la fórmula: PDE (109) = (0,024 × VTT) − 0,76.
Por cortesía de la Dra. Sylvia Bedford-Guaus.
El pene se suele examinar en su estado tumescente mientras se lava antes de la primera recogida de semen. El pene puede variar en tamaño sin ningún efecto sobre la fertilidad. Debe ser libremente extensible desde el prepucio, sin lesiones. Se debe prestar especial atención a la fosa del glande y al proceso uretral durante el lavado. Las lesiones dentro de la fosa del glande pueden causar hemospermia. Las lesiones comunes del pene incluyen las inducidas por traumatismos (es decir, durante la monta o la recogida de semen), así como las producidas por el exantema coital equino, Habronema spp, el carcinoma de células escamosas, los sarcoides y los papilomas.
Por cortesía de la Dra. Sylvia Bedford-Guaus.
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De todos los genitales internos del semental, las ampollas, las vesículas seminales y los lóbulos de la próstata son palpables mediante un tacto rectal. Las vesículas seminales son difíciles de palpar a menos que al semental se le estimule con una yegua en celo para favorecer el llenado de la glándula con líquido. Las glándulas bulbouretrales están cubiertas de músculo, haciendo imposible palpar su estructura.
La ecografía transrectal se puede utilizar para evaluar más a fondo cada una de las glándulas sexuales accesorias y la uretra pélvica. Debido al peligro inherente a la inmovilización adecuada de un semental, solo si se considera necesario por un hallazgo anormal en el resto de la exploración como sangre o pus en el eyaculado, algunos veterinarios llevan a cabo un examen transrectal. Cuando se realiza una palpación por recto en un semental, los anillos inguinales internos deben también palparse para determinar su tamaño y la presencia de cualquier anomalía. Se palpan como pliegues de peritoneo que forman bolsillos en la pared abdominal interna, localizados, según las agujas del reloj, en la posición de las 3 y las 9, a la entrada de la pelvis.
La evaluación del comportamiento sexual y la capacidad reproductora es de crucial importancia, ya que determinará la capacidad de un semental determinado para el eyaculado en una yegua o en una vagina artificial. La libido puede evaluarse exponiendo un semental a una yegua en celo. Un semental con buena libido inmediatamente mostrará interés, evidenciado por inquietud, pataleo, vocalización y actividad precopulatoria caracterizada por olfatear y lamer los genitales de la yegua, así como por mostrar la respuesta Flehmen (curvatura del labio superior para estimular el órgano vomeronasal). Una vez que el semental monta a una yegua o a un maniquí para la recogida de semen, también puede evaluarse la capacidad de empujar y eyacular normalmente. Un semental con una libido normal por lo general mostrará de 3 a 5 impulsos copulatorios fuertes antes de la eyaculación. Cada chorro eyaculatorio (5-7) se puede evidenciar al sentir los pulsos correspondientes en la base del pene, así como por las "ondulaciones de la cola" (la cola se mueve hacia arriba y hacia abajo con cada chorro).
El semen se recoge del semental usando una VA llena de agua a ~50 °C, que suele enfriarse a 42-45 °C en el momento de la colección; algunos sementales pueden estar acostumbrados a temperaturas de VA más altas (50-55 °C) para una estimulación adecuada; sin embargo, la temperatura interna de la VA no debe exceder los 55 °C en el momento de la recogida del semen.
El semental se engaña con una yegua en celo (u ovariectomizada); una vez lograda la erección, el pene se lava con agua tibia y se seca con una toalla de papel. Si se sospecha que la piel del pene alberga bacterias potencialmente transmisibles (p. ej., Klebsiella Pneumoniae o Pseudomonas aeruginosa), debe hacerse un cultivo de una muestra de la vaina y de la fosa del glande antes de que el área peniana se lave y aclare para la recogida del semen. Algo de esmegma puede rellenar el divertículo uretral dorsal, localizado dorsal al proceso uretral, y endurecerse para formar una "judía". Esto puede causar irritación e hinchazón y, por lo tanto, debe evitarse. Después de lavar y secar el pene, se obtiene una muestra de la uretra distal. A continuación, se permite al semental que monte a la yegua o al maniquí (maniquí de monta) y el semen se recoge dirigiendo el pene hacia la VA. Se toma una segunda muestra de la uretra distal inmediatamente después de la eyaculación. Al semental se le debe dar 1 hora de descanso antes de recoger el segundo eyaculado.
Los resultados de los cultivos de las muestras uretrales pueden ser difíciles de interpretar. Los cultivos del prelavado del pene suelen mostrar un crecimiento mixto de bacterias de moderado a alto. Los hisopos de preeyaculado uretral también pueden mostrar un crecimiento de una población mixta de bacterias. El crecimiento de Pseudomonas o Klebsiella puede indicar que el pene está contaminado por estos organismos; en EE. UU., estas son las únicas bacterias (junto con Taylorella equigenitalis, que provocan la metritis contagiosa equina) que, en algunos casos, pueden pasar a las yeguas y causar endometritis. El frotis uretral poseyaculado debe producir menor crecimiento bacteriano porque la uretra se ha "lavado" con el eyaculado. El alto número de bacterias, en especial de una única especie, en el cultivo poseyaculado puede indicar una infección de los órganos genitales internos, frecuentemente la uretra y/o vesículas seminales.
El eyaculado se debe evaluar en cuanto a su apariencia, volumen, concentración de espermatozoides, motilidad espermática, porcentaje de espermatozoides con morfología normal y porcentajes de anomalías morfológicas específicas de los espermatozoides. El eyaculado debe estar libre de pus (piospermia), orina (urospermia) o sangre (hemospermia). El eyaculado normal puede contener gel, un material viscoso, de transparente a turbio, que se origina en las vesículas seminales y forma la tercera y última fracción del eyaculado. Debido a que se expulsa en último lugar, la fracción de gel se puede eliminar colocando un filtro en la boca de la botella de recolección o mejor en la VA, o alternativamente, vertiendo el eyaculado a través de un filtro de leche una vez que se llegue al laboratorio.
El análisis del semen se hace en la fracción libre de gel (rico en esperma). La concentración puede determinarse usando un hemocitómetro o un instrumento fotométrico correctamente calibrado. Varios instrumentos especialmente diseñados para este propósito están disponibles comercialmente. Las evaluaciones de motilidad y morfología de los espermatozoides se realizan igual que lo descrito para el toro; no obstante, la concentración de espermatozoides es mucho menor en sementales (por lo general 100-400 millones/mL), por lo que solo se evalúa la motilidad espermática individual. La valoración de la motilidad debe realizarse tanto con semen fresco como con un semen diluido con un buen diluyente. Después de la extensión inicial, un alto porcentaje de espermatozoides puede mostrar un patrón de motilidad circular que debería resolverse después de 5-10 minutos de equilibrio en el diluyente. El semen debe calentarse a 35-37 °C antes de valorar la motilidad de los espermatozoides.
En particular, las medidas convencionales de la calidad del esperma se correlacionan solo moderadamente con la fertilidad, y las variaciones en los porcentajes de espermatozoides móviles/progresivamente móviles y morfológicamente normales representan solo el 20 % de la variación total en la fertilidad. Dadas las limitaciones de las pruebas estándar de esperma para predecir la fertilidad o identificar a los sementales subfértiles, se han evaluado otras pruebas de esperma que pueden aplicarse para el EAR del semental realizado en centros de referencia. Aunque no proporciona necesariamente una mejor correlación con la fertilidad, el CASA ofrece una evaluación más objetiva y completa de las características del movimiento del esperma. Como en los toros, ciertos cambios en los diferentes parámetros de movimiento, a saber, el aumento de la velocidad curvilínea y la disminución de la linealidad y la rectitud, se correlacionan con la adquisición de una motilidad hiperactivada, que se ha caracterizado recientemente en los sementales. Además, la evaluación de la morfometría (forma) de la cabeza del esperma asistida por ordenador se ha sugerido como una prueba complementaria útil para predecir la fertilidad del semental.
El porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales se evalúa con un aumento de ×1000 utilizando una preparación húmeda fijada con formol (contraste de fases) o un frotis teñido (microscopía óptica). Deben contarse al menos 100 células y registrarse el porcentaje de distintas anomalías. Estas incluyen anomalías de la cabeza, cabezas desprendidas, gotitas citoplasmáticas (proximales y distales), piezas medias dobladas, dobleces en horquilla y colas enroscadas, entre las anomalías más frecuentes. La inserción de la pieza media abaxial se considera normal en el semental.
La integridad de la membrana puede evaluarse fácilmente mediante tinción con eosina-nigrosina (como en los toros). La prueba de tumefacción hipoosmótica evalúa la capacidad de los espermatozoides para hincharse para establecer un equilibrio osmótico con un medio circundante hipoosmótico y también puede tener algún valor para la evaluación de la membrana espermática; sin embargo, no se ha establecido una correlación directa con la fertilidad. Las sondas fluorescentes como la rodamina 123 o la JC-1 junto con la citometría de flujo también se han utilizado para evaluar el potencial mitocondrial y, por tanto, la integridad metabólica. Además, la combinación de estas con otras tinciones fluorescentes ofrece la ventaja de evaluar simultáneamente la viabilidad y la integridad de la cromatina en un gran número de espermatozoides. A este respecto, el ensayo de cromatina de la estructura del esperma, que evalúa la estabilidad de la cromatina del esperma, se ha investigado a fondo en sementales y está correlacionada moderadamente con la fertilidad. Es una buena prueba complementaria para sementales en los que los resultados de las pruebas rutinarias de laboratorio no se correlacionan con la subfertilidad o la infertilidad (véase Pruebas complementarias del semen).
Finalmente, las verdaderas pruebas de la función del esperma (es decir, la capacidad de fertilizar un ovocito) se han restringido debido a la incapacidad para capacitar con éxito el esperma del semental in vitro o para realizar la fertilización in vitro en esta especie. La prueba de respuesta acrosómica se ha descrito como un método para evaluar más a fondo la función espermática en sementales. Esta es la capacidad del acrosoma del esperma para reaccionar cuando se estimula in vitro con ionóforo de calcio. Esto es útil porque un subconjunto de sementales puede mostrar una motilidad, morfología y calidad de la cromatina normales mientras todavía son subinfértiles o infértiles. En algunos de ellos, la única anomalía encontrada es la incapacidad de sus espermatozoides para sufrir exocitosis acrosómica en condiciones de laboratorio.
Además de evaluar la calidad del esperma, una vez que se han recogido dos eyaculados, el número total de espermatozoides en cada uno se calcula como volumen (libre de gel) × concentración. El número total de espermatozoides en el segundo eyaculado de dos recolectados con 1 hora de diferencia se considera una estimación aproximada de la producción diaria de espermatozoides para ese semental (es decir, los eyaculados se consideran representativos si el segundo eyaculado contiene alrededor de la mitad de espermatozoides que el primero). El segundo eyaculado debe presentar el mismo porcentaje o un porcentaje ligeramente superior de espermatozoides morfológicamente normales, así como la misma motilidad que el primero.
Si el número de espermatozoides o su calidad difiere de estas pautas, entonces o se ha producido un almacenaje prolongado de los espermatozoides en los conductos eferentes o uno de los eyaculados no fue completo y debe obtenerse un tercer eyaculado. El tercero debe contener alrededor de la mitad de los espermatozoides del segundo eyaculado y la misma o mejor morfología y motilidad. Puede también recogerse un tercer eyaculado si la evaluación seminal no parece coincidir con la anchura escrotal total (p. ej., un alto número de espermatozoides en un semental con testículos pequeños) o la producción de esperma diaria calculada.
El almacenamiento prolongado de espermatozoides en los conductos eferentes después de un descanso sexual prolongado da como resultado un número alto en el primer eyaculado; sin embargo, estos espermatozoides pueden tener una motilidad y una morfología defiecientes. Algunos sementales con un almacenamiento de espermatozoides extremo requieren una recogida diaria durante 7-10 días antes de obtener un eyaculado representativo (la evaluación del esperma es consistente en las sucesivas recogidas). En casos extremos, el semen puede acumularse en las ampollas y densificarse, causando la obstrucción de los conductos deferentes. Esto puede dar lugar a que en el eyaculado no haya espermatozoides o pocos, por lo general con cabezas desprendidas. Pueden ser necesarios múltiples intentos de recogida antes de que desaparezca la obstrucción. El alivio del bloqueo suele ser evidente por la eyaculación de un gran número de espermatozoides muertos con cabezas desprendidas.
En los casos de obstrucción ampular grave o en sementales con problemas de eyaculación, los intentos de recogida de semen inicialmente pueden producir solo líquido seminal claro. En tales casos, podría estar justificado diferenciar entre estos problemas y la azoospermia (es decir, la falta de producción de esperma) antes de los intentos sucesivos de recogida de semen. Para este propósito, el líquido seminal recogido puede enviarse para la determinación de los niveles de fosfatasa alcalina. Dado que las concentraciones de fosfatasa alcalina son elevadas en el líquido epididimal, un valor <100 U/L es compatible con bloqueo o insuficiencia de la eyaculación, mientras que un valor >1000 U/L es compatible con la acumulación de líquido epididimal y, por tanto, con una verdadera azoospermia.
En un semental con un potencial reproductivo satisfactorio, el número de espermatozoides tras >5 días de descanso sexual debe ser de ≥8-10 mil millones en el primer eyaculado y de ≥4 mil millones en el segundo eyaculado. La motilidad total de los espermatozoides debe ser del ≥65 % y la motilidad progresiva del ≥50 %. Al menos un 50 % de los espermatozoides deben ser morfológicamente normales. Un semental se considera satisfactorio si produce al menos mil millones de espermatozoides progresivamente móviles y morfológicamente normales en el segundo (o tercer) eyaculado de dos (o tres) recogidos con 1 hora de intervalo.
Los sementales se clasifican como reproductores potenciales "satisfactorios", "cuestionables" o "insatisfactorios" basándose en los resultados del examen detallado anterior. Sin embargo, la clasificación puede ser un tanto subjetiva, y un resultado excelente en una categoría puede equilibrar otro marginal de otra categoría. Los reproductores potencialmente satisfactorios deben alcanzar una tasa de concepción estacional de >80 % fecundando a 50 hembras por fecundación natural o a 120 por inseminación artificial bajo condiciones normales de manejo. Los reproductores potencialmente cuestionables pueden experimentar dificultades para lograr lo anterior. Por lo general, los sementales se clasifican en esta categoría si se detecta un problema que podría resolverse con el tiempo con o sin tratamiento; por tanto, se recomienda una nueva revisión en un plazo de 6-12 meses. Los reproductores insatisfactorios tienen problemas que pueden hacer disminuir de forma acusada su fertilidad o tienen rasgos heredables no deseables que pueden transmitirse a la progenie.
Algunos sementales se pueden usar para inseminar un porcentaje de yeguas con semen refrigerado transportado. En estas circunstancias, la longevidad de la motilidad de los espermatozoides debe comprobarse utilizando recipientes de semen comercial antes de llegar a una decisión acerca de la fertilidad potencial. Además, en los caballos, las tasas de gestación con semen congelado-descongelado no solo son subóptimas, sino que dependen mucho del semental. Por tanto, una prueba de congelación-descongelación es esencial antes de usar o comercializar semen congelado de un semental determinado. En particular, una adecuada motilidad y morfología de los espermatozoides después de la descongelación no siempre se correlaciona con buenos resultados de fertilidad, incluso en condiciones óptimas de manejo.
